北极深海沉积物基因组文库构建及一种新的几丁质脱乙酰酶基因鉴定.pdf

摘 要 北极地区是指北极附近北纬66034’北极圈以内的地区，常年被海冰大面积覆盖， 终年寒冷。特殊的环境增加了北极深海微生物的多样性与特异性。目前，对北极深 海微生物研究都是采用传统的纯培养技术，然而，自然环境中99％的微生物都不能 在实验室纯培养，必然还有大量的不可培养微生物资源有待发现。宏基因组技术绕 过纯培养，直接对微生物基因组进行研究，为未培养微生物的研究提供了途径，广 泛应用于各种环境下微生物资源的研究。 I酶切 19质 后，胶回收l“kbDNA片段，与经BamHI酶切处理并去磷酸化处理后pUC 粒连接，转化至DH5a，构建北极$24站位深海沉积物宏基因组文库。每克沉积物 Finder 样品获得2750个克隆子。随机挑取十个克隆测序，通过ORFtool发现除 编码苏氨酸合成酶。虽然该文库库容量有限，但也充分说明北极深海沉积物微生物 及其基因的多样性。 ccs24．2克隆子包含的基因具有所有几丁质脱乙酰酶的功能区域，即多糖脱乙酰 酶domain，但其N段区域长于其他几丁质脱乙酰酶，而C段区域又稍短，表现出 medicaeWSM419 特异性。通过系统发育树分析，该蛋白与a菌纲的Sinorhizobium MS．1亲缘关系最近，单独形成一树，也就是说 及MagnetospirilIummagnetotacticum 该基因很可能来源与a菌纲的菌株。为了鉴定该基因功能，我们对可能的几丁质脱 乙酰酶基因(CD吣眦)设计引物，与BamH 连接，转化至BL21，通过0．5mmoFLIPTG在25℃下诱导表达24h，得到表达产物， 分子量约为43kD，将重组菌裂解后的上清作为粗酶液，以对硝基乙酰苯胺为底物 测定几丁质脱乙酰酶活性证明该基因的确编码几丁质脱乙酰酶。CDA咿邮最适反应 温度为28℃，低于目前已报道的几丁质脱乙酰酶，且热稳定性差，可能由于该基因 来源于北极深海这样一个特殊的寒冷环境，最适pH为7．4，耐碱性强于耐酸性。 关键词：北极深海沉积物，宏基因组文库，几丁质脱乙酰酶，原核表达，活性 测定 Abstract TheArcdc are the66034’inthearcticcircle cold area,all Regionsnearby yearlong andmostoftheArcticOceansurfaceiscovered、航tllseaice．The environment special the and oftheArctic increased diversity present, specificity deep-seamicroorganisms．At theArctic arestudiedthetraditional organisms by pure—culturetechniques． deep—sea inthe themicrobes