富营养化浅水湖太湖中军团菌属的分布及多样性.pdfVIP

摘要 摘要 环境中常见的致病微生物包括病毒、立克次体、支原体、细菌、真菌等。这些 致病微生物广泛存在于水体、大气和固体废弃物如生活垃圾当中，是引起传染病的 罪魁祸首。全球气候变暖和人类活动加剧了湖泊的富营养化过程，进而可能影响水 体中致病微生物的丰度、活性和致病性。目前，致病微生物对于营养盐浓度变化的 响应及其机制的研究开展的较少，还主要集中在部分细菌(如霍乱弧菌)。军团菌 蒂亚克热(Pontiac fever)的病原体。人们通常是由于呼吸了被军团菌污染的水源散 发的水雾而传染上军团病的。截止目前，已发现的军团菌有50多个种，其中近一 半与人类疾病有关。有关军团菌的研究主要集中在人工供水系统，如冷却塔、污水 处理厂、配水系统等，以及对感染军团病病人血清的分析，而对自然环境水体中军 团菌的分布和多样性研究以及军团菌与营养盐的关系的研究相对较少。 太湖水体富营养化严重，不同湖区存在营养盐浓度梯度，富营养化对饮用水的 安全造成威胁。为了解富营养化浅水湖泊中一种致病微生物军团茵的存在情况，我 们选定典型浅水湖泊太湖为研究对象。为揭示太湖军团菌种群的组成和多样性，并 探讨其与营养水平的关系。我们首先建立了一种快速检测环境水样中军团菌属的方 法一巢式PCR方法结合MPN(最大可能数)法。随后，采用该方法分析了太湖 不同湖区32个位点中军团菌的分布情况，结合变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel 游细菌)在太湖不同湖区的的种群多样性，通过对军团菌种群多样性与环境因子动 态变化的多元统计分析，揭示各个湖区中影响军团菌种群结构的主导环境因子，探 讨军团菌的分布和多样性与营养盐的关系。最后通过DGGE典型条带切胶测序方 法，分析不同湖区中军团菌的主要种类，了解太湖不同湖区存在致病军团菌的风险 情况。论文获得的主要结果如下： 1．建立了巢式PCR结合MPN检测环境水体中军团菌的方法，采用两对引物 扩增环境样品的细菌基因组DNA。将检测到含有军团菌的样品DNA模板进行十倍 梯度稀释，由最低检测的稀释度，计算出样品中军团菌的细胞数，同时确定方法检 测的灵敏度。并用克隆建库、构建系统树的方法来验证本文研究方法的特异性。研 究结果表明，巢式PCR后克隆序列均为军团菌序列，本方法的检测限为2．74L f∥u 军团菌DNA。 2．运用巢式PCR-MPN法研究军团菌在太湖不同湖区的检出情况，结果显示， 除五里湖浮游样品外，军团菌在全湖其他湖区均有分布，其中北部湖区(如梅梁湖、 摘要 贡湖)、东南部湖区(如南部沿岸区和东部沿岸区)和湖心区的检出率均在20％以 上。从2月到11月，军团菌的检出率呈现先上升后下降的趋势，最高检出率出现 在8月份的附着细菌样品中，达到75％，最低检出率出现在11月份的浮游细菌样‘’ 品中，为12．5％。总体而言，军团茵在附着细菌样品中检出率均芝50％，而在浮游细 菌样品中检出率12．5％。配对t检验显示，2月份和11月份的检出率在两种生活状 态的细菌样品中存在显著差异，8月份的检出率存在极显著差异。 3．采用DGGE分析阳性样品中军团菌的基因多样性，并计算不同湖区军团菌 均匀度Pielou指数。结果显示，附着细菌样品中贡湖湾和西部沿岸区军团菌多样性 指数和Pielou指数先减后增，最小值都出现在2月份或者5月份，最大值出现在8 月份或者11月份。而浮游细菌样品中梅梁湾、东太湖和南部沿岸区多样性最丰富， 的趋势，而Pielou指数一直减少，最大值均出现在5月份，最小值均出现在11月 份。 4．对DGGE典型条带进行切胶回收测序，共获得68个序列，以97％相似度为 Taxonomic Unit，操作分类单 依据，获得的序列可划分为28个OTUs(Operational 位)