牛GPR54基5’调控区的SNPs及其启动子效率研究.pdfVIP

摘 要 本研究将GPR54基因作为牛早熟性状的候选基因，以本地黄牛、西门塔尔牛、荷 斯坦牛以及皖北牛育种群等为试验群体，通过对牛GPR54基因5’调控区序列进行分 析，以研究5’调控区的多态性、启动效率及其与牛早熟性状的关联性。实验提取牛 耳组织或血液基因组后，利用PCR技术克隆了GPR54基因5’调控区长度973bp的片段 （GPR973） ，通过序列测定、SNP分型、生物信息学预测分析、双荧光素酶报告基因 验证以及方差分析等方法对牛GPR54基因5’调控区GPR973序列进行了功能研究。结 果表明：  1. GPR973序列与山羊和人相应序列的同源性分别为93%和43%； 启动子分析表明  GPR973距CDS起点上游110bp­160bp和744bp­794bp处存在2个潜在的启动子区域，  110bp处的启动子序列内存在一个TATA框。  2. GPR973序列存在 Sox­5、SRY、Mat1­M、Dfd、GATA­2、c­Myb、NIT2、STRE、  MZF1、MyoD、MATa1、cap、Dof2、GCR1、Poly A、GATA­1、AP­4、STATx 和 ADR1  等多种潜在调控元件。  3.  在GPR973序列中检测到两个SNP位点，分别是距离CDS起点上游第754位的  T→C突变 （T754C）和起点上游第816位的C→T突变 （C816T）。在C816T位点，PCR  产物经MaeⅡ酶切出现3种基因型：C816C （157bp和184bp片段）、T816T （341bp片段） 和C816T；在T754C位点，PCR产物经NlaⅣ酶切形成T754T （218bp和123bp片段）、  C754C （341bp片段）和T754C3种基因型。在皖北牛育种群体中，联合2个位点出现4  种基因型：C816CT754T、C816TT754C、T816TC754C和C816CT754C，基因型频率 分别为0.5431、0.4310、0.0172和0.0086，而在西门塔尔牛、荷斯坦牛和安徽地方黄牛 只发现1种基因型，分别为C816CT754T和T816TC754C。  4. 双荧光素酶报告基因验证不同  GPR973 基因型在真核细胞中的启动子效率表 明，带有 GPR973­816CT754 启动子的萤火虫与海肾荧光素酶荧光强度之比显著高于  GPR973­816TC754 启动子，效率提高 79.31% （p0.01） 。  5.  关联分析显示， 816CC754TT基因型牛的初情期比816TT754CC基因型牛的初 情期提前了1.28月，可见GPR54基因的变异与牛早熟性具有一定的关联性。 关键词：牛，GPR54基因，SNP，初情期，启动子效率 I  Abstract  In this study, GPR54 gene was filtered as a candidate gene in the local cattle, Simmental,  Holstein and Wan Bei breeding groups which were gathered as the experimental groups for  prematurity character. This study sought to identify the polymorphism, promoter efficiency,  and theirs Association with cattle prematurityby means of the analysis on the 5’regulatory  region of GPR54 gene in cattle. After genomic DNA was extracted from ear and blood  tissues ofcattles, 973bp sequence in 5’ regulatory region ofGPR54 gene was cloned using  PCR(GPR973). The functions of GPR973 were determined by using sequencing, structure  prediction