牛凝乳酶原基因定点突变与酶性质研究.pdfVIP

㈣1Y9㈣606㈣64 摘要 凝乳酶是酸性蛋白酶，它是组成皱胃酶的一种主要成分，在反刍动物的第四胃产生 105．Met 凝乳酶原，主要是水解K．酪蛋白的Phe 106键。凝乳酶在奶酪加工中应用广泛， 在奶酪生产过程中，它起着凝结牛乳、改善风味的作用。 上扩增牛凝乳酶原基因，双酶切后定向插入到酵母表达载体pKLACl中，构建表达质粒 中，乳酸克鲁维酵母GG799菌株非常适合于牛凝乳酶基因的表达。通过含1％酪蛋白的 7．7。该菌 YEPD平板活性筛选，PCR鉴定，最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌pc kDa， 株分泌表达牛凝乳酶原，经SDS．PAGE分析，证明重组牛凝乳酶原的分子量约为41 符合预期大小，酸化处理后为36kDa，证明可以正确自我剪切。液体培养96h后，酶活 最高达到99．67SU／mL，这为后续的研究提供了基础。该工程菌的获得为进一步优化产 酶条件及放大工艺提供了条件，并为凝乳酶的工业化生产奠定了基础。 采用定点突变的方法来改变凝乳酶基因的碱基，此方法是依据定点突变试剂盒的方 1限制性内 利用高保真PyrobestDNA聚合酶对质粒DNA进行PCR突变反应，然后用Dpn 行测序和筛选、鉴定所需突变株。 通过YCB和YEPDL培养基的筛选，筛选出了五个适合的突变体菌株。我们可以发现， 所有的突变体都可以产生凝乳酶，但是突变体所产凝乳酶的活性较重组菌株的酶活性 低，这表明此位点的改变可能对凝乳酶的折叠影响较小，但是对催化活性的影响较大。 通过结构分析发现本研究所克隆出的凝乳酶为B型，判断的标准为成熟凝乳酶在224位的 氨基酸，A型凝乳酶在224位的氨基酸为天冬氨酸，B型凝乳酶在224位的氨基酸为甘氨 3-7的333位氨基酸由 酸。氨基酸位点的改变对B型凝乳酶的活性影响较大，突变体mpc 天冬酰胺变为亮氨酸，334位的组氨酸变为异亮氨酸，从而导致酶活性的下降，而且突 变体mpc 变会影响酶的活性和热稳定性，但是对酸碱的敏感性没有改变。 发酵液通过50％乙醇沉淀，SephadexG．75分子筛层析和DEAE．52纤维素离子交换层 析进行分离纯化，纯化后经SDS．PAGE电泳鉴定为单一的条带，已经达到电泳纯。重组 7．7的比活力从 凝乳酶和突变体所产凝乳酶在DEAE．52上的行为基本一致。重组菌株pc 粗酶液的114．56 2．1a的比活力从粗酶液的 U／mg提高至1]1609．66U／rag，突变体菌株mpc 54．2 3-7的比活力从粗酶液的37．05 U／mg提高到724．57U／mg，突变体菌株mpc U／mg提高 至1]566．29 U／mg，各菌株都取得了较好的的纯化效果。 通过对酶性质的研究发现，重组菌株pc7．7的最适反应温度范围为30．550，最适pH 范围为4．0-5．5，其Km和Vmax分别是0．02 2．1a mg／ml和0．0214 mg／m1．mira突变菌株mpc 别是0．0122 mg／ml和0．002mg／m1．mira突变菌株mpe