猪肌肉生长抑制前肽基因定点突变载体的构建及其原核表达.pdfVIP

中文摘要 生长因子f；(TGF—B)超家族的重要成员之一，它能够抑制肌纤维的增长，因 此对骨骼肌的生长发育起负调控作用。煅肼是一种分泌蛋白，主要由骨骼肌产 生，并且以无生物活性的前体蛋白形式在血液内循环，当机体需要时，这种前体 蛋白经过两次蛋白酶酶切加工，形成具有生物学活性的同源二聚体，并以浓度依 赖性的方式对肌肉生长发挥负调控作用，限制肌纤维生长。猪懈Ⅲ前体蛋白由 白运输到内质网膜后首先被切除信号肽，然后在266位氨基酸处被金属蛋白酶酶 切去掉前肽(N端)，剩余109个氨基酸残基的成熟肽(C端)通过其中9个半 胱氨酸之间的二硫键形成同源二聚体，与细胞膜上的受体相互作用，通过3种 Smad蛋白的介导将信号传入细胞核，作用于靶基因的调控区，从而实现对骨骼 肌数量和粗细的调节。鼠解州前肽的第76位天冬氨酸(Asp)(猪第75位)是 金属蛋白酶家族BMP．1／TLD的特异性切割位点，髑Ⅲ前体被该蛋白酶处理后， 能释放本来与前肽非共价结合的C端二聚体，使C端二聚体能够与相应受体结 合，激活下游信号通路。将该天冬氨酸突变为丙氨酸(Ala)后，突变的前肽仍能 与C端二聚体结合形成潜在复合物，但这一突变却使前肽能够抵抗BMP．1／TLD 蛋白酶家族成员的特异性切割作用从而有效地抑制C端二聚体的活性，降低 粥Ⅲ对肌纤维的抑制作用进而导致肌纤维数量的增多和肌纤维粗度的增加。 船矾突变前肽的这种作用为医学上治疗肌肉萎缩和在畜牧业上提高动物 肌肉产量、培育动物新品种提供新的研究方法和研究思路。因此，具有很好的应 用前景和经济价值。本研究以通城猪妊娠3个月的胚胎为材料，提取背最长肌总 IⅢA反转录获得cDNA，以此为模板PCR扩增脸7’Ⅳ前肽序列并将其连接到原 核表达载体pGEX-6p-1上。然后将该序列上第75位编码天冬氨酸的密码子变为 一)D75A。重组质粒转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21感受态细胞并经工PTG 诱导表达。结果表明，转化pGEX-ProM(SP-)质粒的E．coliBL21工程菌用 总分子量约为51kD的融合蛋白(GST标签分子量为26kD，胳州前肽分子量为 1．78mg／mL和1．2l mg／mL。本研究优化了大肠杆菌表达猪MSTN前肽的条件，提 高了表达效率，为研究删前肽在动物体内的生物学功能以及单克隆抗体的制 备奠定了基础。 关键词：猪，肌肉生长抑制素，前肽，突变，原核表达 II AbStraCt as anddi虢rentiationf．actor l(Ilown 8(GDF-8)， Myost{ltin(MSlN)，alsogrowIll isamembe】roft11e fIactor can t啪sfoming莎owch ofskeletal actsasa ofskeletal inllibit muscle，so，it negatiVeregulator the鼬owm muscle isaHndofsecreted geIleratedbythe gro、硼1．Myostatin protein，mainly hasn0 aS Which a11dcirclllatedintlleblood skeletalmuscle precursorprotein me this fomsa needs