番茄,辣椒和胡卜的精细胞以及卵细胞的分离.pdfVIP

摘要 摘要 高等植物的卵细胞深藏在子房内的胚珠体细胞组织中，而精细胞位于花粉营 养细胞中。受精过程和胚胎发生过程则在珠心内的胚囊中完成，这对高等植物受 精机理研究形成了很大的障碍。而将高等植物的精、卵细胞和其他雌配子体细胞 分离出来，在体外诱导精、卵细胞的融合以及对人工合子和其他分离得到的雌配 子细胞体外进行细胞生物学和分子生物学的研究可克服这种障碍。本实验中，我 们尝试分离番茄、辣椒和胡萝卜具有生活力的精、卵细胞，为进一步的研究番茄、 辣椒和胡萝b雌雄配子体的分子生物学特性及受精机理等提供了条件。 1．番茄精、卵细胞的分离：番茄的花粉属于二胞型。本实验采用直接爆破 花粉粒的方法分离具生活力的生殖细胞，并收集成群体。尝试离体萌发花粉管及 活体一离体培养花粉管，成功分离到具生活力的精细胞。以开花当天的胚珠为材 料，用酶解一解剖法分离得到一定数量的卵细胞、助细胞及中央细胞。在最佳条 件下，30分钟可从70个胚珠中分离出7个卵细胞。通过微吸管进行收集，在短 时间内可得到一定数量的卵细胞及助细胞群体。对分离胚囊细胞的最佳渗透压条 件和酶液成分、含量进行了筛选。 2．辣椒精、卵细胞的分离：辣椒的花粉属于二胞型。本实验采用直接爆破 花粉粒的方法分离具生活力的生殖细胞，并收集成群体。并采用活体一离体法培 养花粉管，成功分离到具生活力的精细胞。辣椒的子房内有多个胚珠，取开花当 天的胚珠，尝试用酶解一解剖法分离胚囊细胞。在最佳条件下，30分钟可从54 个胚珠中分离到6个卵细胞。分离的辣椒卵细胞经FDA染色后，荧光显微镜下观 察其呈明亮的绿色荧光，表明其具有较强的生活力，而部分卵器中两个助细胞其 荧光的强弱存在明显的差异。用显微操作仪可收集到一定数量的卵细胞，以作为 进一步研究辣椒卵细胞的分子生物学特性的实验材料。 3．胡萝卜糟、卵细胞的分离：胡萝卜花粉属于三胞型。在多种爆破液中， 花粉粒都没有反应。用两个解剖针挤压胡萝卜花粉粒使其破裂释放出精细胞，达 到分离、收集胡萝b精细胞的目的。用酶解一解剖方法分离胡萝卜胚囊中的卵细 胞、助细胞和中央细胞。胡萝卜胚珠先在酶液中酶解40-50min，然后将其转移 到不含酶的分离液中用解剖针解剖胚珠。将胚珠的合点端切破，轻轻挤压胚珠的 摘要 珠孔，卵细胞、助细胞和中央细胞即可逸出。在最佳条件下，20分钟可从20个 胚珠中分离出5个卵细胞。对分离胚囊细胞的渗透压和酶液成分进行了筛选。分 离出的胡萝卜精、卵细胞用显微操作仪收集到一定数量，以作为进一步研究胡萝 卜卵细胞的分子生物学特性的实验材料备进一步用。 目前被子植物离体受精技术只在玉米和水稻两种植物中获得了完全成功。双 子叶植物的离体受精还没有获得成功。番茄、辣椒和胡萝卜精、卵细胞的成功分 离为在双子叶植物中进行离体受精探索打下了基础。被子植物卵细胞发育和受精 调控机制的研究目前还基本上是空白，这三种双子叶植物精卵细胞的分离也为研 究生殖细胞发育和受精调控机制创造了一定条件。 关键词 生殖细胞；精细胞；卵细胞；分离 2 Abstract Our offertilizationmechanismof is limited understanding higherplantsvery becausethe ofthe of s咖ctureinwhichthemaleandfemale complexityreproductive aleembeddedinvarioussomatic theSuccessof gametes deeply tissues．Following isolationofmaleand砖male of invitrofusionofbo