短引物的聚合反特性以及核苷酸衍生物对EcoRI的酶切阻滞作用.pdfVIP

目 录 一、摘要……………………………………………………．1 中文论著摘要……………………………………………．．1 英文论著摘要……………………………………………．．5 二、英文缩略语………………………………………………10 三、论文……………………………………………………11 论文一……………………………………………………．．11 前‘言…………………………………………………．11 日Ⅱ舌…………………………………………………·ll 材料与方法………………………………………………13 实验结果………………………………………………．．16 讨论…………………………………………………．24 结论…………………………………………………．28 论文二……………………………………………………．．29 前‘言…………………………………………………．29 刖青…………………………………………………·么了 材料与方法………………………………………………3l 实验结果………………………………………………．．35 讨论…………………………………………………．43 结论…………………………………………………．50 四、本研究创新性的自我评价……………………………………5l 五、参考文献………………………………………………．．52 六、附录……………………………………………………59 综述……………………………………………………59 在学期间科研成绩…………………………………………72 致谢……………………………………………………73 个人简介………………………………………………．．74 ·摘要· 。甲又化者于l萄晏。·中文论著摘要· 短引物的聚合反应特性以及核苷酸衍生物对EcoRI的 酶切阻滞作用 刖 吾 核酸是最重要的生物大分子之一。它是遗传信息从亲代向子代传递的物质基 础。在细胞中，核酸的合成、切割、连接、变构、修饰等众多反应无时不在，对 于维持正常基因组的复制和修复、实施基因表达的调控具有重要的作用。包括聚 合酶、内切酶、连接酶、重组酶在内的多种酶类参与了这些反应。由于这些核酸 作用酶类独特的酶促活性，它们成为许多基础研究和应用研究中的重要工具酶。 其中DNA聚合酶和限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease，l也)是应用最为广 泛的两种酶。 DNA聚合酶催化引物延伸反应。它遵从碱基互补配对原则，以单链DNA为 模板，将引物的3’末端不断延伸，形成与模板链互补的双链。通过‘解链一退火 一延伸’的多次循环，DNA聚合酶可以使DNA模板得到上百万倍的扩增，实现 chain 扩增微量核酸样品的目的。聚合酶的应用以及聚合酶链反应(polymerase reaction，PCR)技术的发明极大地推动了核酸研究的发展和进步。然而，即使在最 常见的DNA聚合酶引物延伸反应中，依然有许多尚未解决的问题。DNA聚合酶所 能聚合的最短引物长度是多少?不同聚合酶聚合所需的最短引物长度是否相同? 聚合酶在催化短引物时有何反应特性?催化效率受哪些因素的影响?这些问题都 有待系统的研究。 限制性核酸内切酶，特别是II类限制性核酸内切酶，可以识别特定的核酸序 列，并在特定的位点切断核酸双链，形成粘性末端或是平端切口。限制性核酸内 切酶广泛的应用在分子克隆、基因工程、合成生物学中。另一方面，近些年来， 核酸化学在合成新的核苷酸方面取得了巨大的进步。这些新合成的核苷酸衍生物 可以提高核酸的双链亲和力、提高识别错配碱基对的能力、改善对体内核酸酶的 抵抗力等。由于这些优点，它们在反义核酸领域得到了应用。但是核苷酸衍生物 对限制性核酸内切酶的影响研究却十分有限。 本论文将探讨KF(Klenow DNA聚合酶在短引物延伸反应中 fragment)和Taq 的催化特性，以及几种核苷酸衍生物(2’甲氧基核苷酸、2’氟核苷酸、5．甲基胞嘧 啶核苷酸等)对限制性核酸内切酶EcoRI酶切反应的影响。