白僵菌提取物对氨酸酶活性抑制作用的研究.pdfVIP

摘要 酪氨酸酶广泛存在于人、动物、植物和微生物中，是参与黑色素合成的关键 酶。酪氨酸酶活性越高，生成的黑素也越多，其表达和活性决定着黑色素生成的 速度和产量，控制其活力即可控制黑素生成量，因此酪氨酸酶抑制剂临床应用于 与黑色素失调相关疾病的治疗且在美白化妆品应用方面具有重要作用。 白僵菌作为生物防治中被应用最广泛的虫生真菌，多年来对其发酵产物中生 物活性物质的研究少人问津。本研究采用安徽农业大学微生物防治重点实验室多 年采集保藏的众多白僵菌菌株中挑选 44 株不同来源、不同寄主、不同地理来源 的白僵菌作为实验对象，并对其分别进行静置发酵培养和摇床发酵培养，共得到 88 个培养物，对培养物进行真空冷冻干燥，然后用甲醇提取其中的活性物质以 进行以酪氨酸酶二酚酶抑制率为指标的初筛实验。筛选结果显示有 12 个样品对 二酚酶的抑制率高于 50%，分别为：Bbr03 （摇床）、Ba08 （摇床）、Bb307 （摇 床）、Bb2513 （摇床）、Ba03 （摇床）、Ba09 （摇床）、Ba14 （摇床）、Ba14 （静置）、 Bbr59 （摇床）、Ba01 （静置）、Ba07 （摇床）、Ba08 （摇床）。 以抑制单酚酶活性和二酚酶活性作为评价指标，对初筛的 12 个样品进行复 筛实验，结果表明 Ba03 具有比其它 11 个样品更高的抑制率表现，对酪氨酸酶单 酚酶和二酚酶的抑制率分别为 75.06%和 64.43% 。 通过单因素实验及正交实验对 Ba03 菌株抑制酪氨酸酶活性成分的培养条件 进行优化，发现 Ba03 菌株产活性成分的最佳培养基组成为：麦芽糖 20 g/L 、甘 油 20 g/L 、黄豆粉 23.3 g/L 、K HPO 0.05 g/L 、MgSO ·7H O 0.03 g/L、MnSO ·H O 2 4 4 2 4 2 0.001 g/L 。最佳培养工艺为：培养时间 12 天、种龄 7 天、接种量 10 ml、培养温 度 25 ℃、摇床转速 180 rpm。 酪氨酸酶的 IC50 的测定实验结果表明，Ba03 菌株发酵液提取物的单酚酶活 性的 IC50 为 223.38 μg/ml，二酚酶活性的 IC50 为 327.58 μg/ml 。 采用 RP-HPLC 和活性测定联合分析发现，Ba03 甲醇提取物中的活性组份主 要有 3 个部分，它们在 HPLC 上的保留时间分别是 24-26 min 、30-32 min 和 32-34 min 的流份。用制备高效液相色谱（Prep-HPLC ）对 Ba03 甲醇提取物中酪氨酸 酶抑制剂进行了分离制备，得到活性组份 B-1 、B-2 和 B-3 。高分辨质谱分析结 果显示，该活性组分的可能分子式分别为 C H N O 、C H N O 和 C H N O 。 30 55 5 5 10 14 6 4 10 12 2 2 天然产物数据库查询发现它们对应的化学物质可能分别为槲寄生酰胺、2’-氨基 -2’-脱氧鸟苷和一种新化合物。 关键词：白僵菌，酪氨酸酶，抑制作用，培养条件，提取工艺 I Abstract Tyrosinase exists in people, animals, plants and microorganisms. It is a key enzyme involved in melanin synthesis. The Higher tyrosinase activity is ，the more melanin generated. The expression and activity of tyrosinase determines the speed and productio