白念珠菌烯醇化及其N端肽段的原核表达和应用研究.pdfVIP

中文摘要 摘 要 白念珠菌是一种常见的条件致病菌，也是念珠菌感染中居于首位的病原茵。近 年来，随着大量免疫抑制剂、化疗药物和广谱抗生素的广泛应用，侵袭性念珠菌感 染(invasive candidiasis，IC)的发病率和死亡率不断上升。现阶段仍然缺乏能早期、 敏感而特异性检测侵袭性白念珠菌感染的方法。国内外研究已经把注意力集中于检 测患者血液中的自念珠菌特异性抗原成分及其代谢产物上。白念珠菌烯醇化酶即是 目前研究较多的一类免疫优势抗原，检测病人血清中烯醇化酶抗原及其相应抗体可 以区分侵袭性感染和单纯的定植，为IC的诊断提供有力的依据。 目的： 应用分子克隆和原核表达技术，获得白念珠菌烯醇化酶的全长重组蛋白及N端 肽段EN01。3 19P：制备相应的多克隆抗体；为建立快速诊断侵袭性念珠菌感染新的 血清学检测方法提供试剂原料。 方法： 以自念珠菌C1标准株基因组DNA作为模板，用PCR法扩增烯醇化酶的全长 IPTG诱导重组融合蛋白表达。用抗his6标签的单克隆抗体和白念珠菌抗体阳性的 病人血清进行Westernblot鉴定，TALON金属亲和柱层析纯化重组蛋白。以纯化的 融合蛋白作为抗原分别免疫家兔和山羊制备多克隆抗血清，并检测抗体特异性。另 通过念珠菌与人体细胞内烯醇化酶氨基酸序列的同源性比对寻找同源性低的区域， 并通过原核表达技术获得序列特异性更高的肽段EN01．319P，并建立检测病人血清 中EN01．319P抗体的ELISA方法以评估其在侵袭性念珠菌病早期诊断中的价值。 结果： 先获得了含白念珠菌烯醇化酶全长基因的重组表达载体和相应工程菌株，测序 结果证明克隆的烯醇化酶基因序列完全正确，经IPTG诱导后能高效表达重组融合 蛋白。使用重组蛋白制备了针对白念珠菌烯醇化酶的兔抗血清及羊抗血清。后来又 成功克隆了白念珠菌烯醇化酶N端1-319位氨基酸的肽段，获得的重组肽段经病人 血清Westernblot鉴定表明有良好的抗原性，以之建立的ELISA抗体检测方法敏感 (6／200)。 中文摘要 结论： 成功克隆了白念珠菌烯醇化酶及其N端肽段EN01．319P并在大肠埃希菌中获 得高效表达，并以纯化的重组蛋白制备抗EN01多克隆抗体。为IC的早期诊断建 立检测白念珠茵烯醇化酶抗原和相应抗体的血清学方法打下了基础。 关键词：白念珠菌，烯醇化酶，N端肽段，原核表达，多克隆抗体 H Abstract Abstract the Candiada of became oppormrhsticpathogen，has major albicans(C．albicans)，one ofinvasive and ofIChasbeen pathogen candidiasis(IC)．Themorbiditymortality inrecent in which immunocompromisedpatients increasingglobal years，particularly those corticosteroidsor weretreatedwith receivinghigh-dose chemotherapy,orpatients