PUMA介导缺复氧大鼠心肌细胞凋亡的实验研究.pdfVIP

摘要 摘要 凋亡引起的心肌细胞损失是缺血／再灌注损伤(ischemia／reperfusioninjury,IRll 的重要病理特征。阐明对心肌IRI中心肌细胞凋亡起关键性作用的蛋白质及其信 号转导机制，对揭示心肌IRI的本质寻找并确立药物靶点，有效防治心肌IRI 具有重要的现实意义。 p53上调凋亡调制物(p53 modulatorof upregulated 凋亡蛋白质，能隔离所有的Bcl．2抗凋亡蛋白质作用。PUMA在多种病理性因素 的刺激下通过p53依赖和非依赖途径激活介导细胞凋亡，在凋亡通路上发挥着举 足轻重的作用。 拟在体心肌IRI，探讨促凋亡蛋白PUMA是否介导H／R诱导心肌细胞凋亡的发生? 遏制PUMA表达是否可以下调心肌细胞凋亡而达到减轻H／R损伤的作用? 第一部分：PUMA在大鼠心肌细胞H／R损伤中的作用及意义 目的： 应用乳鼠原代心肌细胞H／R损伤模型，探讨PUMA在大鼠心肌细胞H／R损 伤中的作用及意义。 方法： 原代培养的心肌细胞被随机分为5组，实验重复3次。①正常对照(contr01) 组；(g)H／R 2h组；@H／R4h组；④WR6h组；@nm12h组。采用生化自动分 析仪测定LDH活性、MTT法测定细胞存活率、AnnexinV．FITC和PI联合染色 的流式细胞术检测凋亡率、RT-PCR和Westemblot方法检测PUMA及凋亡相关 变化。 结果： 1、H／R诱导心肌细胞凋亡 IV 摘要 H／R处理后心肌细胞凋亡率迅速上升，其中以H／R6h最为明显，细胞凋亡率 12h Caspase3 活性达峰值为Control组的(4．57±0．48)倍(尸I0．05)。 2、H／R诱导PUMA及凋亡相关蛋白Bax、Bcl．2表达变化 H／R mRNA RT-PCR图像分析显示：PUMA2h开始升高(0．45±0．05)，6h达 峰值(O．764-0．06)，持续到12h(0．71 Bax mRNA在H／R mRNAH／R 相比，Bcl．2 0．05)(P0．05)。 Western 2h开始升 Control组(O．68±0．07)相比，Bcl．2蛋白H／R 至最低(O．26±0．02)(P0．05)。 ． 结论： H／R诱导心肌细胞凋亡。PUMA在正常培养的心肌细胞中表达很低，心肌 细胞H／R后迅速上调，其表达变化与心肌细胞凋亡率、Caspase3活性变化及凋 亡相关蛋白Bax表达变化J下相关，与Bcl．2表达变化负相关，提示促凋亡蛋白 H瓜诱导的心肌细胞凋亡。 V 摘要 i 第二部分：PUMA特异性SRNA对大鼠 心肌细胞H／R损伤的影响 目的： 讨si．PUMA对心肌细胞H／R损伤的影响。 方法： ②H／R6h组；③转染错义siRNA+H／R h后，制备心肌细胞H／R损伤模 组(si．PUMA)。siRNA干扰心肌细胞PUMA表达36 型，在H／R 损伤的作用。观察指标和方法同前。 结果： 1、si．PUMA特异性下调心肌细胞PUMA表达。si．PUMA组PUMA