R-乙基-3-基戊二酸酯间接生物合成路径转化新体系的建立.pdfVIP

． 摘要 摘要 他汀类药物作为非常有效的降血脂药物，是全球的畅销药。尤其是第三代他河类药物瑞 舒伐他汀在治疗冠状动脉疾病方面表现出非常好的疗效。3,5．二羟基庚酸侧链是瑞舒伐他汀 的关键性侧链，它是由手性化合物月。乙基．3习径基戊二酸酯合成而来。因此，震一乙基一3一羟基戊 二酸酯是当前研究的一个热点。开发离效率、低成本、低污染的依乙基．3一羟基戊二酸酯生产 工艺，对于降低瑞舒伐他汀价格，提高产品质量，增强我国制药企业在该领域的国际竞争力， 具有深远的意义。本研究旨在开发以屉乙基．4．氰基．3．羟基．丁酸酯为底物的熙乙基一3-羟基戊 二酸酯高效生物合成方法。 (1)检测方法的开发。目前尚未有检测方法可以同时实现良乙基一4．氰基一3一羟基一丁酸 酯、R。乙基．4．氨甲酰基．3．羟基丁酸酯和R．乙基．3．羟基戊二酸酯在线检测的分析方法，丽这 三种物质同时在线分析对于确定反应路径具有重要作用。通过对三种化合物的缩构和性质的 分析，基于离子化合物在高效反楣色谱洗脱中的特殊性质，最后确立了实现三种化舍物同时 ODS C18柱； 分离的液耩方法。对流动相组成和pH值进行优化，最优洗脱条件为：Hypersil nm；流动相为甲醇／50 检测波长210 mM磷酸钠盐缓冲液(3：7F，v／v，pH6．5)：柱温40℃。通 过验证，结果显示该方法具有良好的线性，重复性，专一性，较低的检测限和定量限，较短 的样品分析时间。 (2)目标菌株的筛选。邋过对采自江苏梅山和海南五指山的两份土样进行选择性筛选和 显色筛选，获得了一批具有腈水解酶活性的野生菌，但活性相对较弱，未能达到实际生产的 要求。采用PCR高通量筛选方法，对混合菌落基因组DNA进行筛选，获褥两条腈水解酶基 boritolerans在转化 因的保守序列。对实验室已有的腈水解酶产生菌进行筛选，RhodoCOCCUS 当前底物屠乙基．4．氰基。3．羟基-丁酸酯产生R．乙基13．羟基戊二酸醣上，表现出很好的活性。 (3)反应路径的确定及化合物鉴定。为了进一步了解该反应进行的路径，反感过程进行 全程取样监控。高效液相检测结果显示该反应存在中间体，可能是一个由两步反应组成的间 接反应。通过以尽乙基．4．氨甲酰基．3．羟基丁酸酯为底物进行上述反应，最终得到只．乙基一3一 羟基戊二酸酯，由此进一步证实以上间接路径。将上述中间体和产物分别进行质谱、超导核 磁共振(NMR)、旋光分析，结果显示以上分析数据与R。乙基．4．氨甲酰基．3．羟基丁酸酯和 小乙基．3．羟基戊二酸酯已报道的相关数据一致。因此，该反应的路径最终确定为以欠，乙基珥一 boritolerans中可能同 氨甲酰基．3．羟基丁酸酯为中间体的间接路径，并由此推断Rhodococcus 时存在腈水合酶和酰胺酶。 (4)反应条件优化。通过对酶催化反应的溢度、pH、底物浓度进行优化，得到该反应 的最佳反应条件为：25℃，pH7。5，10龃。R-乙基．4．氰基一3．羟基．丁酸酯。在该反应条件下， 反应的最终转化率达到98．5％(w／w)，这是疆前报道的从n乙基-4。氰基．3-羟基一丁酸醮到R一 乙基．3．羟基戊二酸酯的最高转化率。加之该反应底物处理量较大，所以优化后的反应体系比 较适合于R．乙基．3．羟基戊=酸酯规模化婀工业生产。 boritolerans为催化剂，R一乙基一4一氰基一3·羟基一丁酸酯为底物 本研究首创以Rhodococcus 一 ．二——————型尘鳖耋鬯些箜丝圣—皇罡曼曼曼舞曼曼一 璺舅曼皇皇曼皇曼曼曼蔓曼曼曼皇曼曼量曼曼皇曼曼曼曼曼暑1222———一。 篆戮裟慧害豢鬻镭销黧： 羟基戊二酸酯生物合成体系之最，且工艺成本低，生严过程碌笆I、补俅’叫伺舣级肝爿刚。“ 药生产：的环境约束力。 关键词间接路径；离子化合物；Rh。如c