产乳糖酶酵母菌的遗传改良和乳糖酶的发酵生产.pdf

产乳糖酶酵母菌株的遗传改良和乳糖酶的发酵生产 摘要 marxianus)具有代谢底物广、耐热性好 马克斯克鲁维酵母菌(KluyvPrDmyces 及比生长速率快等多种优良特性，并且能合成大量的乳糖酶、菊粉酶、p一葡萄糖 苷酶和其它酶，因而引起国内外学者的广泛关注。与其它种类的微生物相比，该 酵母菌是一类在食品工业中普遍采用的微生物，用作酶源非常合适。 微生物中普遍存在葡萄糖阻遏现象，当有葡萄糖存在时，许多酶的合成和基 因表达都会受到抑制。参与葡萄糖阻遏作用的主要为Snfl复合体和Migl蛋白， 当培养基中葡萄糖浓度较高时，Snfl复合体去磷酸化，Snfl复合体失去活性， 这时Migl由于不能被磷酸化，进入细胞核中与受葡萄糖阻遏基因的启动子结合， 使基因表达受到抑制，说明Migl在菌株的酶合成和调控中起重要的作用。如果 将编码Migl的MIGl基因敲除，相关基因的阻遏效应解除。因而本研究通过基 因敲除法阻断足marxianuskm菌株MIGl基因，然后研究该基因的敲除对该菌 株酶的合成和相关基因的表达产生的影响。首先利用编码潮霉素的肿丁基因的 得了敲除菌株km．15，它能在含有2．脱氧．D．葡萄糖的乳糖培养基平板上生长， 而野生型菌株km则都不能，表明敲除菌株葡萄糖阻遏作用解除。与野生型菌株 km相比，敲除菌株km．15的乳糖酶、菊粉酶和D．葡萄糖苷酶的产量均有很大提 marxianus 高，同时编码这些酶基因的表达量也有极大提高。这表明，K km中 的Migl确实能阻遏某些基因的表达，对一些酶的合成具有调控作用。 对敲除菌株km．15产乳糖酶培养基进行了优化，确定了最佳培养基成分为 1．0 oC、 (w／v)：乳清粉10．0％、酵母粉1．5％、蛋白胨1．0％和MnCl2mM。在28 7．0条件下180 h，km．15菌株乳糖酶产量为111．7U／mL。经 pH rpm振荡培养48 过2．L发酵罐发酵，该菌株乳糖酶产量提高到121．7U／mL。同时，确定了酶法水 解乳糖的适宜条件，艮lJ-％糖浓度9．O％(w／v)、乳糖酶使用量为440 oC、 U／g乳糖、40 7．0和水解时间2．5h，在这种条件下乳糖水解率为99．2％。在同样条件下， pH 12．0％(w／v)的乳清粉经过该酶水解3．5 h后，乳清粉中乳糖水解率为98．7％。 调节乳糖酶使用量为260 mL牛奶中，水解3．0 U／g乳糖添加到5．0 h后，牛奶中 乳糖水解率为99．3％。将上述水解液进行薄层层析，结果显示水解产物只有单糖， 即葡萄糖和半乳糖，其中的乳糖完全水解，表明该乳糖酶在食品工业中具有潜在 的应用价值。 就上面所说的那样，该酵母菌还产菊粉酶。对敲除菌株km—l5产菊粉酶培 养基进行了优化，确定了最佳培养基成分为(w／v)：菊粉8．0％、酵母粉3．O％， 4．5的条件下180 在28。C、pH rpm振荡培养42h，km．15菌株菊粉酶的活力为 69．0 U／mL。分别以菊粉和菊芋汁作为碳源，经过2．L发酵罐发酵，发酵48h和 60 h后，菊粉酶活性分别为79．9U／mL和73．3 U／mL。然后，确定了酶法水解菊 粉的适宜条件，即菊粉浓度6．0％(w／v)、菊粉酶使用量为400 oC、