三种食源性致病多重PCR快速检测方法的研究.pdfVIP

摘要 食品安全作为一个重大的世界性公共卫生问题，越来越受到人们的重视。在各类 食品安全事件中，由细菌引起的食物中毒事件占有较大的比例，是引起食物中毒的重 要因素之一。其中，沙门氏菌(Salmonella)、单增李斯特氏菌(Listeria 和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia 们能够污染多种食品。目前，国内检测食品中致病菌主要采用传统的分离、培养、生 化鉴定的方法，其操作繁琐，检测时间较长，通常需要一周才能完成，且灵敏度较低， 已经不能满足食品中致病菌快速灵敏检测的需要。与普通PCR有相同原理的多重PCR 是一种快速、高效且高通量的检测方法，能同时检测多种食源性致病菌，节省成本和 时间，该方法在致病菌检测领域有着广泛的应用前景。 本研究根据沙门氏菌菌毛砌瑾因、单增李斯特氏菌溶血素J1．蚴基因和小肠结肠 炎耶尔森氏菌粘附侵袭位点口f瑾因设计了三对特异性引物，建立了同时检测三种食源 性致病菌的多重PCR方法。根据影响多重PCR反应的因素，利用两个正交试验设计分 10xPCR 度进行优化，最终确定多重PCR反应体系为25此：3．8IxL buffer，1．5¨L M92+(50 pL mmol／L)，0．3“LU／“L)，沙门氏菌上 retool／L)，3．0dNTPs(各2．5 Taq酶(5 下游引物1．0“L(10lamol／L)，单增李斯特氏菌上下游引物1．5laL(10p,mol／L)，小肠结 肠炎耶尔森氏菌上下游引物O．5 8．9 pL(10lamol／L)，模板各0．5“L，ddH20laL；反应 程序为：94℃预变性5min，94℃变性45S，59．8℃退火45S，72℃延伸45S，进 min。 行30个循环，最后72℃延伸10 通过引物特异性和反应特异性试验，证明该方法具有较好的特异性。多重PCR扩 产物的确是目的基因的扩增且同源性均达到99％以上。为了比较多重PCR检测三种致 病菌的特异性及灵敏度，建立单重PCR检测体系作为对照。在最佳实验条件下，多重 PCR同时检测三种食源性致病菌纯培养物的灵敏度沙门氏菌为102CFU／mL、单增李斯 特氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌均为103CFU／InL；采用试剂盒法提取DNA，在人工 污染猪肉品中同时检测三种食源性致病菌的检出限沙门氏菌为103 CFU／g、单增李斯 特氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌均为104 CFU／g，其灵敏度和检出限均略低于单重 PCR检测。人工污染猪肉样品经9h富集培养增菌后，其检出限可达100 CFU／g。 对实际样品进行检测，并与国标法进行比较，证明该方法检测三种食源性致病菌 具有较高的敏感性、特异性和符合率。本研究建立的多重PCR检测方法简单、快速、 准确、灵敏度高、低成本、高通量，具有较强的实际应用价值，对控制病原微生物的 传播，预防食物中毒的发生有着积极的意义。 关键词：多重PCR；正交试验；检测；食源性致病菌 Food-borneBacterial for DetectionofThree on PCRRapid StudyMultiplex Pathogens Name：WangRujing Major：Microbiology