三重PCR快速测婴幼儿奶粉中的病原菌.pdfVIP

摘要 食源性疾病是食品安全的主要问题，时刻威胁着人们的健康和生命。在食源性疾 病中，细菌性食物中毒居首位。近年来，阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆 菌等病原菌引起的奶粉中毒事件时有发生。因此，食源性病原菌的检测是食品卫生安 全检测中一个重要的部分。 目前，对食品中病原菌的检测方法主要有传统的分离鉴定方法、免疫学方法和分 子生物学方法。其中，传统检测方法操作繁琐，检测时间较长，灵敏度较低；免疫学 方法的特异性和灵敏度不是很理想：分子生物学方法特异性较强、检测时间较短、灵 敏度较高。 三重PCR是一种在同一反应体系中加入三对特异性引物，同时扩增出三条目的 DNA片段的扩增方法。本文根据阪崎肠杆菌的外膜蛋白基因ompA、金黄色葡萄球菌 的耐热核酸酶基因tltlC、蜡样芽胞杆菌的溶血素基因hblA设计了3对特异性引物，进 行三重PCR反应，可实现对阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌三种食源 性病原菌的同时检测。对15株菌进行检测，结果4株阪崎肠杆菌、2株金黄色葡萄 球菌、1株蜡样芽胞杆菌均扩增出了特异性的目的条带，而另外的8株其它病原菌均 无扩增条带。将阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌的扩增产物测序序列在 DNA Polymerase等参数的优化，确定了三重 度、3对引物、M92+、dNTPs、EasyTaq PCR的反应体系和反应程序，其反应体系为：10xEasyTaqBuffer(．M92+)2．5“L， 2．5mMdNTPs2．5 mM 1．5¨L，10“M lxL，50 MgS04 ompA上下游引物各0．6I．tL、10laM hblA上下游引物各1．0 nuc上下游引物各1．O此、10lxM U／p．L gL，模板DNA各2此，5 DNA 0．3 mira EasyTaqPolymeraselxL，ddH20补足25此；反应程序为：95℃预变性5 S，61℃45s，72℃45 min。 按照94℃45 S进行30个循环；最后72℃延伸10 将阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌三种病原菌随机组合，均能扩增 出特异性的目的条带。在最佳试验条件下，该三重PCR方法同时检测阪崎肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌三种病原菌纯培养的灵敏度是103CFU／mL。采用无 水乙醇、氨水、石油醚与试剂盒相结合的方法提取DNA，该三重PCR方法同时检测 阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌三种病原菌在婴幼儿奶粉中的检出限是 方法对阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌三种病原菌的敏感性均为100％； 特异性分别为96．4％、96．6％、100％；符合率分别为96．7％、96．7％、100％。 本研究以婴幼儿奶粉中出现过的阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌为 对象，建立了检测这三种病原菌的三重PCR方法，为同时检测食品中的阪崎肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌提供了新方法。 关键词：三重PCR；婴幼儿奶粉；病原菌；检测 Powder PCR Detectionof BacteriainInfantMilk byTriplex Rapid Pathogenic Name：Li Yangyang Major：Microbiology