刺糖多孢菌am基因的克隆与功能研究.pdfVIP

摘要 氮素是生物体内蛋白质、核酸和一些辅因子等含氮化合物的重要 组分，它的代谢作为一种重要的生命活动，广泛存在于所有的生物体 中。而氨(铵离子)是被生物体吸收的最为经济有效的一种氮素形式， 是生物体内氮素转运的的主要形式之一。铵离子作为氮素代谢的中心 环节，是生物体内所有氮源的最终代谢产物和生物体内所需的氨基 酸、核酸和辅因子等氮类化合物的生物合成的底物。生物体对环境中 的NI-14的吸收和NH4+在组织间的转运，是由位于细胞原生质膜上的 NH4+转运蛋白(铵载体)介导的需能主动运输过程。因此，我们在和刺 糖多孢菌亲缘关系较近的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)M145和变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)TK24中过量表 环境，并进一步探讨铵转运蛋白Arnt对M145和TK24代谢的影响。 本论文以刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)基因组为模板 扩增铵转运蛋白基(ammoniumtransportergene)，并对其进行测序， 经过酶切、连接，并回收，将其连入pMDl8．T载体中，转化大肠杆 菌ToplO，构建到大肠杆菌．链霉菌穿梭载体pMF上，再借助接合转 移，将该基因导入天蓝色链霉菌M145和变铅青链霉菌TK24中，在 双向启动子PactUIII的作用下过量表达铵转运蛋白，比较转化子和野 生型的表型，分析该基因的过量表达对天蓝色链霉菌M145和变铅青 链霉菌TK24代谢的影响。 对原始菌株和接合子进行固体平板培养和液体摇瓶发酵培养，并 进行了次生代谢产物放线紫红素产量的测定和菌体形态观察，结果发 并没有很大差别。接种R4C固体培养基，观察色素和孢子形成情况， 并且色素形成的起始时间比两株对照菌都要早。 本研究首次从刺糖多孢菌中克隆了铵转运蛋白，并且在链霉菌模 式菌株中进行了初步的功能研究，为后续的研究工作奠定了基础。 关键词：铵转运蛋白；链霉菌；异源表达；接合转移 II Abstract isa constituentofcellular such Nitrogenveryimportant components as acidandanumberofcofactorscontain proteins，nucleic as nitrogen oneof theelements．Themetabolism acriticalrolein nitrogen plays all living oneofthemost organisms．Ammonia(ammoniumion)is convenientformof absorbedthe isalsooneof nitrogen by organism，it the main formof ion in transport thecenter nitrogen．Ammonium being of metabolismisthe of