嗜热厌氧乙醇杆体外转录系统的构建及应用.pdfVIP

摘要 摘要 嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacterethanolicus)作为嗜热菌中乙醇产 量较高的菌种，它具有高生长温度，较好的耐酸性以及完整的纤维素和半纤维素 代谢系统，这些优点使其成为乙醇生产茵改造的热点。转录系统因背景干扰低， 反应组分明确，结果清晰准确成为研究菌体转录情况的有力工具。本研究构建 ethanolicus Z JW200中的未知蛋 ethanolicus的体外转录系统，并运用该系统对Z 白Tethll的功能进行研究。 ·。 体外转录系统的构建关键是获得RNA聚合酶。这方面的研究主要是通过异 源菌表达体外重组RNA聚合酶以及提取天然菌的RNA聚合酶两个方面来进行 的。体外重组中，首先分别构建含有伐、p、p’、∞和。亚基的表达载体pET-alpha-His、 源表达并纯化获取纯的亚基。其中将仅、p、p’和∞按照2．2：1：1：1的比例进行 体外重组RNA聚合酶核心酶，并通过His-tag亲和层析技术获得了纯化的核心酶。 天然酶的纯化是利用聚乙醇胺粗沉淀与NaCl抽提、硫铵沉淀、肝素亲和层析以 ：及DEAE阴离子交换层析技术经过4步纯化获得了纯度为95％天然RNA聚合 ethanolicus 酶核心酶。另外我们根据Z JW200中的adhB基因及其侧翼序列并以 粒为模板分别用重组RNA聚合和天然RNA聚合酶进行转录，使用地高辛染色 ．检测转录产物，重组RNA聚合酶没有检测到酶活而天然RNA聚合酶转录出预 计大小的条带。 TethlI作为一个背景完全未知的蛋白，我们采取生物信息学预测蛋白结构， 电泳迁移率变动分析和体外转录实验对其结构和功能进行研究。首先根据该蛋白 N段氨基酸序列的测序结果，我们将该蛋白的基因克隆到pET-28a(+)中。测 序结果表明该蛋白有297 kD。NCBI比 bp，编码98个氨基酸，理论分子量为11 对结果显示该蛋白一级结构上具有两个保守区域，一个在8-11个氨基酸之间， j另一个位于第43个氨基酸和第83个氨基酸之间，在三级结构上该蛋白具有螺旋 ．转角．螺旋的DNA结合模体。通过电泳迁移率变动实验验证，Tethll能特异性 结合在adhE基因上游第一个启动子与第二个启动子之间的区域，不与adhB基 nMTRRadhE 因上游启动子区域结合。当Tethl1终浓度为320nM时，可以将5 完全结合。运用本论文中构建的体外转录系统对该蛋白功能进一步研究，结果显 示该蛋白扮演阻遏蛋白的角色同时抑制adhE两个启动子的转录。 南室堕蔓奎堂兰!!!星婴主堂垡笙奎： 一—————————————————————————————一 关键词：RNA聚合酶，蛋白质表达纯化，体外转录系统，转录调控因子，电泳 一 迁移率变动分析 Ⅱ Abstract and ofThermoanaerobacterethanolicus Constructiongapplication in vitro system； transcription Abstract ethanolicusYW200isa Thermoanaerobacter Gra