探针熔解曲线分技术用于PIK3CA基因突变检测.pdfVIP

摘要 摘要 磷脂酰肌醇3．激酶(Phosphatidylinositol 激酶家族，P13K／AKT信号通路的活化在很多类型的肿瘤中都会导致异常的细胞增生。 PIK3CA基因编码I 10a，研究发现它在多种人类肿瘤中发生功能 A类P13K催化亚基pl 性突变，导致P13K激酶活性增加，进而导致整个信号通路活化，因此PIK3CA基因突 变被认为在肿瘤治疗中有预测预后功能，并可以作为药物开发的靶点。随着越来越多 P13K信号通路靶向抑制剂的开发，对于PIK3CA基因突变的检测变得越来越重要。本 研究利用分子生物学的方法，基于实时PCR平台建立检测体系检测PIK3CA基因外显 子9及外显子20上的突变，为PIK3CA基因突变的检测提供新策略。 第一章，首先介绍了P13刚削I汀信号通路在肿瘤发生发展中的作用，随后介绍了 的检测方法并提出了本研究所开发的两种新策略。 第二章，介绍了改良分子信标探针熔解曲线分析方法的建立，该方法相较于直接测 序法提高了突变检测灵敏度，对于PIK3CA基因突变的检测较全面，且具有快速，简便， 易于实现高通量检测的特点，并且避免了22q11．2同源基因(98％)的扩增使得检测更 准确。本检测体系对于突变DNA的选择性可达5％~10％，灵敏度可达30拷贝／反应， 体系特异性及重复性良好。在对122份肿瘤组织标本检测中结直肠癌标本检出突变8 标本测序为野生外其余均与测序结果一致，说明本检测方法较测序更为灵敏。 第三章，针对3个热点突变建立单管多重ARMS探针熔解曲线分析方法，该方法 的特异性ARMS引物对突变起到富集作用，提高了野生背景下的突变检测灵敏度，与 前章所介绍的方法相互补充，相互验证。本体系对于突变DNA的选择性可达O．5％，灵 敏度可达30拷贝／反应，体系特异性及重复性良好。在对122份肿瘤组织标本检测中结 测序验证中除5份突变标本测序为野生外其余均与测序结果一致，且此5份中的3份为 普通体系检出突变而测序野生的标本，显示了ARMS体系突变检测更为灵敏的优点。 关键词：PIK3CA突变；熔解曲线分析；扩增阻碍突变系统 ABSTRACT ABSTRACT a of kinasesinvolvedincell Phosphatidylinositol3-kinases(P13K)arelargefamilylipid activationoftheP13K／AKT inanumberoftumor causes signaling．The pathway types in and PIK3CAwhichencodes abnormalitiescell inthe growthproliferation．Mutationsgene thell0a subunitoftheclassIAP13Khavebeen in of p catalytic reportedmanytypes PIK3CAmutationswhicharefunctionalactivecause cancers．Theofthe may presence gene oftheP13K／AKT ita useful up—regulation signalingpathway,makingpotentiallytherapeutic