探针熔解曲线分结合多种引物扩增技术在K-ras基因突变检测中的应用.pdfVIP

摘要 摘要 肿瘤等疾病往往伴有多种体细胞突变，近年来，某些基因的突变情况已经作 为癌症预后和治疗疗效预测的一种生物分子标记物，服务于分子靶向治疗。在化 疗无效的结直肠癌患者中，针对EGFR的靶向治疗药物目前取得了重大进展。但 大量研究表明，患者一旦携带有K-ras基因第2号外显子密码子12和13上的突 变，就表现出对EGFR靶向治疗药物的耐药。因此，K．ras基因的突变与否可作 为结直肠癌患者进行EGFR靶向治疗的有效预测因子。 体细胞突变往往存在大量的野生型背景，对检测技术的要求极高。本论文以 探针熔解曲线分析为基本技术平台，结合不同的引物扩增技术和PCR策略建立 并验证了三种针对K．raS常见七种突变类型的检测体系，三种体系所探讨的方法 都有望用于其它体细胞突变的检测中。 在第一个体系中，我们将探针熔解曲线分析技术分别与不对称PCR和不对 称快速COLD．PCR结合起来，并对两种扩增技术的检测能力进行了比较。结果 表明，不对称快速COLD．PCR对突变模板的富集能力约为普通体系的10倍。使 用快速COLD．PCR后，对于Tm值降低的五种突变类型，体系的选择性从普通 体系的5％提高到了O．5％。本体系简便快速，一管一次反应即可对七种常见突变 进行准确筛查，缺点是无法确知样品的突变类型。 在第二个体系中，我们将探针熔解曲线分析技术与序列特异性引物的不对称 PCR扩增结合起来，建立了针对K．raS常见七种突变的八管检测体系。此体系的 优点是选择性可以达到0．01％．O．5％，可以区分样品的突变类型，缺点是管数较 多，操作起来比较麻烦。 在第三个体系中，我们将探针熔解曲线分析技术与人工熔点标签标记的引物 扩增技术结合起来，建立了针对K．ras常见七种突变的两管检测体系。人工熔点 标签技术实现了一管多个突变的同时筛查与区分。优点是两管体系操作简便，选 择性较高(0．5％)，可以区分样品的突变类型。 三种体系检测结果的Kappa一致性检验表明，三种体系的一致性很好。 本论文所探讨的方法有望用于其它体细胞突变的检测中。 摘要 关键词：K．ras；探针熔解曲线分析；不对称PCR 2 ABS下RACT ABSTRACT mutationsareoRenfouIldincanc既Inrecent somatic Somatic yearS，seVeral in aS molecularmarkerswhichareused mutationsare roles taking biological aIld iIl seⅣesinmolecular callcer，which therapye衢cacyprediction progIlosis EGFRhaVemade in agaillSt sigllificantprogress ta唱etedtIler印y．RLrgetedther印ies mmlberofstudies metaustaticc010rectalcancer