激活蛋白Pea1在烟草细胞膜上的结合位点及其特性.pdfVIP

激活蛋白PeaT1 在烟草细胞膜上的结合位点及其特性 摘 要 激发子是目前生防领域中研究最热门的生物分子之一，这种生物分子最大的特点就是对病原菌 或昆虫没有直接的杀伤作用，而是通过提高植物自身的“免疫”能力来达到抗病和抗虫效果的，另 外，一些激发子还具有抗逆和促生长的作用，所以激发子是目前十分理想的生防材料之一。虽然人 们已经发现了许多类型的激发子，比如：寡糖、脂类、肽、糖肽、蛋白质和糖蛋白等，但是关于它 们是如何在植物上起作用的机理还并不十分清楚，尤其是对起广谱抗性的激发子。本文重点研究了 一种蛋白激发子PeaT1 在烟草细胞上的作用位点以及该位点的生化特性。首先用极低浓度的PeaT1 处理烟草悬浮细胞，发现PR -1a 基因的转录被诱导增强，同时用相同浓度的PeaT1 溶液处理烟草植 株，不同时间取样发现酸性 PR 蛋白被诱导表达，这种现象说明烟草细胞上存在某种组分可以接收 并识别来自胞外的信号。为了搞清楚这种组分，本试验采取了多种标记方法对PeaT1 的作用位点进 行追踪，主要结果如下：（1）利用荧光素FITC 标记纯化的PeaT1 蛋白分子并与烟草悬浮细胞孵育， 激光共聚焦显微镜观察发现PeaT1 可以与悬浮细胞结合，并且结合在细胞表面，与对照相比较，这 种结合具有特异性。（2 ）利用酶解法制备烟草细胞原生质体；对原核表达的PeaT1 进行纯化，用高 纯度的PeaT1 蛋白做抗原制备兔多克隆抗体，利用免疫荧光法及激光共聚焦显微镜观察发现PeaT1 可以与烟草细胞的质膜结合。（3 ）为了进一步说明烟草细胞质膜上PeaT1 结合位点的特性，一方面 利用差速离心法制备烟草细胞膜囊系统，进一步通过亲水两相系统纯化出质膜膜囊；另一方面将激 125 活蛋白PeaT1 用放射性同位素 I 标记，将两者进行孵育发现：PeaT1 与烟草细胞质膜的结合具有 专一性、饱和性和可逆性的特点。将PeaT1 基因分段表达后，每段的结合能力显著下降，说明PeaT1 与结合位点的结合需要其完整性。（4 ）为了进一步了解该结合位点的化学特性，在提纯的烟草细胞 125 3 质膜和 I 标记的激活蛋白 PeaT1 孵育结合以后，使用化学交联剂 BS 将两者共价交联并进行 SDS，最后进行放射自显影发现：PeaT1 可以与细胞质膜上的2 个分子结合；分别将提纯的烟 125 草细胞质膜加热或用蛋白酶处理。再将放射性同位素 I 标记激活蛋白PeaT1 与之结合，则结合不 能发生，说明上述的2 个分子具有蛋白质特性。（5 ）为了进一步获得激活蛋白PeaT1 互作分子的更 为详细的信息，利用双向电泳结合Far Western Blot 以及生物质谱技术，鉴定出与激活蛋白PeaT1 结 合的分子可能为 1 个22 kDa 的跨膜多肽。 关键词：激活蛋白PeaT1 ；烟草细胞质膜；结合位点；共价交联；蛋白互作 II Characterization of the binding site for the protein elicitor PeaT1 on tobacco plasma membrane Abstract Presently, elicitor is one of the most popular biomolecule in controlling plant diseases. Elicitors are inducers of plant defense genes and the chemical natures of them are different including protein s, glycoproteins, lipids, and oligosacchari