棉花害虫防治新标漆酶基因的初步研究.pdfVIP

ClassifiedIndex: CODE:10075 U.D.C.: NO ADissertationfortheDegreeofM.Science ThepreliminaryresearchofLaccase geneasanewtargetofcottonpest control Candidate: XiaJiehan Supervisor: AssociateProfessorLiJigang AcademicDegreeAppliedfor: MasterofScience Specialty: Botany University: HebeiUniversity DateofOralExamination: June,2014 摘 要 摘 要 Laccase 漆酶 （ ）是一种结合有三个铜离子的蓝色多铜氧化酶，可以从各种有机底物 4 上催化转移 个自由电子使氧气还原为水。漆酶主要催化一个通过电子转移发生的氧化 还原反应过程。棉铃虫是一种夜蛾科昆虫，为全世界最重要的农业害虫之一，在世界各 棉区均有分布，主要危害棉花、玉米、高粱等多种农作物。漆酶在棉铃虫表皮形成和鞣 化过程中起着关键作用，可以做为新型害虫抑制剂的靶标酶，而且漆酶在工业上极具应 用价值。因此，棉铃虫的漆酶基因成为研究棉铃虫的重要研究对象。本文首先克隆出棉 铃虫漆酶基因并对其进行生物学分析。主要包括以下几个方面： 1 cDNA PCR （）以棉铃虫 为模板，设计特定引物进行 扩增，将目的基因片段连接 到pUCm-T载体，成功地克隆出了棉铃虫漆酶基因。测得cDNA序列长为2280bp，含 有完整的开放式阅读框。去除信号肽编序列码后的实际克隆序列长为2211bp，编码737 个氨基酸。 2 （）通过生物信息学对测序结果进行分析，棉铃虫漆酶基因与其它鳞翅目昆虫的 漆酶基因有较高同源性。同时对漆酶的蛋白质结构做出分析。棉铃虫漆酶二级结构中α 1.22% β 22.93% 75.85% 螺旋占 ， 折叠占 ，圈环和其它随机结构占 。 3 Xcm pET17ba （）本实验验证了一个基因定向克隆的使用方法。通过 Ⅰ对 进行酶 3’ C T 切，得到线性化的定向克隆载体，该载体两个末端的 端分别突出一个 和一个 碱 基。测试分析表明，可保证PCR产物直接定向克隆于表达载体。通过该方法将前面克 隆得到的laccase基因产物进行连接，转化，成功构建漆酶的原核表达载体。所提出的 新定向克隆方法，提高了重组载体的构建的工作效率，可降低实验成本。测序分析表明 通过上述方法构建的Laccase基因载体正确。 关键词： 棉铃虫 漆酶 基因克隆 序列分析 载体构建 原核表达 I Abstract