抗玉米赤霉烯酮克隆抗体的制备及其应用.pdfVIP

摘要 摘要 高粱等粮食作物中。它性质稳定、能耐高温，可引起动物发生雌激素中毒症，对 人也有一定的毒害作用。ZEN不仅具有生殖发育毒性、免疫毒性、肝毒性、细 胞毒性和遗传毒性，对肿瘤的发生及内分泌系统也有一定的影响。 目前，用于检测玉米赤霉烯酮的分析方法主要分为三类：色谱检测法、微生 物检测法和免疫学检测法。这些方法各有利弊，比较而言，专一性强、灵敏度高、 快速方便、操作简单、成本低、可一次性检测大量样品的免疫学检测法(比如应 用单克隆抗体的ELISA检测方法)显得更为方便实用，越来越受到检测机构的 欢迎和研究人员的重视。 国内针对ZEN的检测试剂盒目前仍主要来源于进口，价格十分昂贵。因此， 建立其灵敏、可靠、快速的ELISA检测法，发展高质量的国产试剂盒具有重要 意义，可以为我国进行粮食和饲料中ZEN的污染情况调查及制定国标ZEN建议 值提供技术支持。 本研究采用羧甲基羟胺半盐酸盐一步合成出半抗原，然后直接用活泼酯法将 半抗原与载体蛋白偶联成完全抗原，并利用单克隆抗体技术制备了灵敏度高、专 样品加标回收实验说明了本实验建立的CI。ELISA检测方法是稳定、可靠的。 1、半抗原及全抗原的合成与鉴定。采用羧甲基羟胺半盐酸盐一步合成出半 抗原，然后直接用活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联，操作步骤简单，而且所使 用的试剂都很普通，容易获得。通过TLC、HPLC和液相．质谱联用技术三种方 法依次进行半抗原的鉴定；采用紫外光谱法、结合比的测定以及免疫学方法进行 全抗原的检测，结果皆表明目标半抗原及全抗原合成成功。 后血清效价在1：8000以上。利用细胞融合技术和单克隆抗体技术，筛选到l株 可稳定分泌针对ZEN的抗体的杂交瘤细胞株3D10。实验结果显示，该细胞上清 中抗体的稳定性较好，效价基本保持不变。用3D10杂交瘤细胞株制备腹水，腹 水效价可以达到1×106。其与ZEN结构类似物有一定的交叉反应，而与其他三 种参试真菌毒素基本没有交叉反应，说明其特异性较高。腹水对ZEN具有较高 为0．225弘g／mL，IClo值为4．93ng／mL。 摘要 3、CI．ELISA检测方法的建立。确定了间接竞争ELISA的最佳工作条件： 最佳封闭条件为2％浓度的脱脂奶粉(PBS溶解)；包被抗原的最佳工作浓度为 21．tg／mL；腹水的最佳稀释倍数为1×106倍；样品提取液乙腈的最佳浓度为10％。 CI．ELISA标准曲线，其 在本实验建立的CI．ELISA最佳工作条件下，建立ZEN 范围内，呈良好线性。 4、小麦中ZEN添加回收实验。ZEN的回收率在75．150／旷82．69％，变异系数 在10％以内。采用本实验建立的CI．ELISA方法对实际小麦样品进行了ZEN的 含量测定，并将检测结果与HPLC的检测结果进行了比对分析，两者的结果基本 一致。 关键词：玉米赤霉烯酮，真菌毒素，单克隆抗体，酶联免疫吸附测定(ELISA) II Abstract Fusarium a by gr口m。，le口r“聊· malrayproduced mycotoxin Zearalenone(ZEN)is different as in cereals，such dismuted Itis、Ⅳidelv thatdoesnot athightemp