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棉花纤维不同发育阶段蛋白质组的比较分析 摘 要 棉花纤维是从胚珠外表皮细胞分化而来的单细胞，是纺织工业的重要原料，具有重 要的经济价值。其分化和发育过程由四个相互重叠的时期组成。在棉纤维发育过程中， 有大量蛋白发生改变。研究这些与棉纤维发育相关的蛋白，并探讨其功能，不仅可以深 入认识棉纤维伸长和纤维素生物合成的机制，还可以为改良棉花纤维品质奠定基础。 本研究以陆地棉徐州142 为材料，比较了三种不同蛋白质提取方法以及不同裂解液 组成对双向电泳的影响，并在蛋白上样量和染色方法等方面进行了探索与优化。结果表 明，利用饱和酚- 甲醇醋酸铵法提取的棉花纤维蛋白，其蛋白含量较高，且 SDS 电泳条带清晰；样品溶解于含有硫脲和CHAPS 的裂解液中，其蛋白溶解度增加；不同 的蛋白上样量比较结果表明，第一向等电聚焦固相pH 梯度胶条(7 cm) 的最适上样量为 125 µg；同时，经改良后的考马斯亮蓝法染-脱色后，2-DE 图谱的背景清晰，分辨蛋白 斑点数增加。 利用差异蛋白质组学比较了棉花纤维伸长及初生壁形成期(10 DPA)和次生壁增厚 期(25 DPA)蛋白质组的变化；利用PDQuest 软件分析各个差异蛋白在10 DPA 和25 DPA 棉花纤维中的相对表达量，选取质量好、重复性高的15 个蛋白质点进行MALDI-TOF-MS 鉴定。于NCBI 上进行数据查询，这 15 个蛋白分别是 F-box 家族蛋白、肌动蛋白、ß- 微管蛋白、F -ATP 合成酶、ATP 酶ß亚基、膜联蛋白、磷酸甘油酸酯激酶I、胞质苹果 1 酸脱氢酶、S-腺苷- L-高半胱氨酸水解酶、谷氨酰胺合成酶、Cu/Zn 超氧化物歧化酶、 profilin 、4-香豆酸辅酶A 连接酶。上述蛋白参与能量代谢、碳代谢、细胞周期调控和发 育等。推测出现的蛋白质组变化可能与棉花纤维次生壁发育相关。 根据MALDI-TOF-MS 鉴定结果，比较了5、10、15、20 、25 和30 DPA 6 个时期棉 花纤维蛋白质组的 2-DE 胶图谱的差异。根据目的蛋白核苷酸序列设计特异引物，对5 种差异蛋白进行半定量RT-PCR 分析。结果显示目的蛋白在蛋白水平和转录水平上存在 差异。 关键词：棉花纤维；次生壁；蛋白质组；MALDI-TOF-MS ；半定量RT-PCR I Comparison of Proteome in Cotton Fiber Cell during Different Development Stages Abstract Cotton fiber is a single and highly elongated epidermal cell of the outer integuments of the ovule . As the most prevalent natural raw materials used in the textile industry, cotton fibers plays a significant role in the global economy. Growth of fiber cells can be divided into four distinct and overlapping stages : initiation, elongating, secondary cell wall synthesis and maturation. There are amount of proteins actively expressed during fiber development. Isolation and analysis of proteins expressed preferentially in cotton fiber will be helpful in further understanding the complicated process of fiber cell elongation and cellul