ANNEXIN VPI法检测凋亡.docVIP

一、原理 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依 赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 ? 二、常见试剂盒组份 组份 ? ? ? ? Annexin V-FITC 50μL 100μL 250μL 500μL Binding Buffer 5 mL 10.0 mL 25 mL 25 mL×2 Propidium Iodide （PI） 50μL 100μL 250μL 500μL ? 三、操作步骤 1.悬浮细胞离心（2000rpm离心5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）； 2.用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1~5×105细胞； 3.加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞； 4.加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀； 5.室温、避光、反应5～15min； 6.请在1 hour内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。 A.荧光显微镜观察 1.滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞； 2.对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡； （1） 将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组； （2） 用PBS洗涤细胞两次； （3） 在500μL 的Binding Buffer中加入2μL Annexin V-FITC， 5μL Propidium Iodide，混匀； （4） 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖； （5） 避光、室温反应5 min。 3.将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片（FITC和罗丹明）观察 Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。 B.流式细胞仪分析 用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。 荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。 四、注意事项 1.Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。 2.Propidium Iodide （PI）有毒，操作时要戴手套。 3.本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，，不适用于检测组织样本。 4.推荐使用悬浮培养细胞，如果是贴壁细胞，用胰酶消化不当，会引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。 5.因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。 五、储存 置于40C，可保存一年