鸡avbd2成肽在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性分析.pdfVIP

摘 要 鸡源抗菌肽是牛物体受到外界病原微生物入侵时产牛的一类带正电荷的小 分子活性多肽。而鸡B一防御素(Avianbeta—defensin)作为抗菌肽中较为重要的一 种，因其抗菌谱广且效率高，作用机制独特，不易使病菌对其产牛抗性等特点， 在抗牛素的抗药性日趋严重的情况下，极有可能成为新的抗牛药物的来源，也因 此鸡B一防御素成为了人们当前研究的热点之一。本实验选鸡B．防御素．2(AvBD2) 作为研究对象，运用基因工程技术，将人工合成的AvBD2成熟肽基因成功克隆 到含有AVBD2目的蛋白的上清液，对上清产物的抗菌活性进行了研究。具体内 容和结果如下： 1 AvBD2成熟肽基因的人工合成 204992)cDNA编码区序列，在 根据NCBI报道的AVBD2(登录号：NM 构建成克隆载体pMDl8．T-simple．AvBD2。 2AVBD2成熟肽在毕赤酵母中的表达及体外抑菌试验检测 鉴定，测序结果经BLAST比对显示，构建的表达载体中的AvBD2成熟肽基因 与GenBaIll(中公布的一致，同源性达100％。然后将获得的重组分泌表达质粒 11 5，筛 选出阳性克隆后用甲醇诱导，表达上清经Thcine．SDS．PAGE和抑菌实验检测， 结果表明，AvBD2成熟肽基因成功整合到GSll5的基因组中，得到了能够表达 知AvBD2蛋白分子量在5．8kDa左右，表达上清能抑制包括大肠杆菌 (CMCC45103)在内的多种细菌的牛长。 3AVBD2成熟肽表达上清对雏鸡感染大肠杆菌病的预防效果研究 以罗曼蛋鸡为对象，初步研究了不同浓度的AvBD2成熟肽表达上清对致病 菌感染雏鸡的预防效果。本实验选用了禽致病性大肠杆菌CVCCl565感染雏鸡， 在确定了细菌两次最佳攻毒剂量后，对11日龄雏鸡连续腹腔注射5天不同浓度 的表达上清液，每天每只O．2mL。于21日龄时经腹腔注射l×109c纠mL大肠杆 菌CVCCl565，0．5 mL／只。观察48h后如果PBS对照组仍有雏鸡存活，则再经 腹腔注射1×108cm／mL大肠杆菌CVCCl565，0．5mL／只。之后再观察48h，确 定PBS对照组雏鸡全部死亡后停止感染。结果发现，两次攻毒试验之后，注射 不同浓度表达上清液组雏鸡全部存活，而空酵母表达上清对照组部分存活，PBS 对照组雏鸡全部死亡。由此表明，AvBD2成熟肽表达上清显示出了较好的体内 预防效果。 综上所述，本研究成功构建了pPIC9k．AvBD2表达载体，将该表达载体电转 化到酵母体后经甲醇诱导表达，啊cine—SDS—PAGE检测到分子量在5．8kDa左右 用；在禽致病性大肠杆菌感染雏鸡的试验中，注射AvBD2不同浓度表达上清组 与空酵母表达上清组、PBS对照组相比，死亡率均极显著降低(P0．01)，表达 上清显示了较好的预防效果。 关键词：AVBD2，成熟肽，毕赤酵母，分泌表达，抗菌活性 Abstract Thechicken antimicrobial which p印tides wcre when generatedextemal inVaded pathogenlc chickenwere mlcroo唱anisms smaUmolecule positivelycha略ed actlVe one