鸡夭藤尖物质提及体外抗hbv作用研究.pdfVIP

鸡矢藤活性物质提取及体外抗HBV作用研究 中文摘要 蔓生草本植物，有较强的臭味。鸡矢藤作为常用的中草药之一，丰要用于治疗与肝 脏相关的疾患。本课题以HepG2．2．15细胞作为靶细胞，采用MTT比色法观察不同浓 度下鸡矢藤提取物对细胞的毒性作用；并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法测定 细胞培养上清中HBsAg，HBeAg的含量，以此评价鸡矢藤提取物体外抗HBV的作用。 目的： 1．提取鸡矢藤挥发油，检测挥发油成分及对其HepG2．2．15细胞的药效作用。 2．提取鸡矢藤浸提物质，进行细胞毒性试验，确定有效成分的部位。 3．提取鸡矢藤多糖，进行细胞毒性实验。确定有效成分的部位。 4．检测以上提取物质在最大无毒浓度下对HBsAg、HBeAg的分泌抑制。 方法： 1．鸡矢藤药材的预处理 5细胞株筛选体系的优化 2．HepG2．2．1 1)通过不同的培养时间，确定达到筛选标准的最低培养时间。 2)检测筛选药物G418对于HepG2．2．15细胞的培养必要性。 3．水蒸气法与有机溶剂法提取鸡矢藤挥发油 1)挥发油提取条件的优化 2)两种挥发油的GC．MS分析 3)挥发油助溶剂的筛选 5细胞的毒性作用 4)MTT法检测鸡矢藤挥发油对HepG2．2．1 5)CPE法确定鸡矢藤挥发油对HepG2．2．15细胞的最大无毒浓度 6)鸡矢藤挥发油对HepG2．2．15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制 4．鸡矢藤浸提物质的提取 1)多种方法提取鸡矢藤浸提物质，并确立最优方案。 2)鸡矢藤浸提物初步细胞毒性试验 3)大孔树脂HP20分离鸡矢藤粗提物质 5细胞的抑制作用 4)各洗脱组分对HepG2．2．1 5)鸡矢藤浸提物质对HepG2．2．15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制 H 6)各洗脱组分Hoechst33258荧光染色细胞形态观察和流式细胞术检测细胞凋 亡情况 7)各洗脱组分化学成分的初步鉴定 8)黄酮和鞣质含量测定 5．鸡矢藤多糖的提取 1)鸡矢藤粗多糖的提取 2)粗多糖除蛋白方法的优化 3)鸡矢藤粗多糖的分离纯化 4)鸡矢藤多糖分离组分初步鉴定 5)鸡矢藤多糖分离各组分对HepG2．2．15细胞的毒性抑制作用 6)鸡矢藤多糖分离组分对HepG2．2．15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制 结果： 效果优于添加G4l8培养。 2．初步得到两种鸡矢藤挥发油，水蒸气法优于有机溶剂提取法，1％DMSO是 合适的挥发油助溶剂。鸡矢藤挥发油在3lu∥mI～2000u∥mI的浓度范围内对 为23．64％。 3．确立最佳提取方案为75％水提醇沉。粗提取物经大孔树脂HP20层析洗脱，得 2 到5种洗脱物质，其中1 0％、20％乙醇洗脱部位对HepG2．2．15细胞有诱导凋亡作用， 经过检测，主要成分为黄酮类物质。 4．鸡矢藤多糖经过DEAE纤维素层析洗脱，得到5个组分，鸡矢藤多糖对 有一定的抑制作用。 结论： 1．鸡矢藤挥发油是鸡矢藤散发特有气味的丰要物质，鸡矢藤挥发油得率较低。 仅为0．23％。最大无毒浓度下，对HBsAg、HBeAg仍有一定的抑制作用，是有效的 低毒物质。 2．鸡矢藤水浸75％醇沉物质经过HP20大孔树脂洗脱，其中lO％，20％乙醇洗脱 部位对HepG2．2．15细胞有诱导凋亡现象，经初步检测，该组分的主要成分为黄酮类 物质。 3．鸡矢藤多糖对HepG2．2．15细胞没有毒性，在最大无毒25m∥ml浓度下，对于 HBsAg、HBeAg分泌有一定的抑制作用。 MTT：流式细胞术 3 Extractionofactivesubstancesfrom，切Pd锄．sc口月胁sPandtheir e