鸡avbd7成肽在大肠杆菌中的表达及抗菌活性分析.pdfVIP

摘 要 AvBD7成熟肽是一种拥有42个氨基酸残基的鸡B一防御素，属于阳离子抗菌 aIltimicrobial 多肽(Cationic p印tides，C√WPs)，是鸡体内先天性和获得性免疫的 重要成分。它具有抑菌谱广、抗菌力强且不易使病原微生物产生抗药性等优点， 是一种具有非常良好应用前景的“抗生素替代品”，如何对其进行大规模生产应 用己成为目前的研究热点。 为了探索鸡B．防御素在大肠杆菌表达系统中的表达水平及体外抑菌活性情 况，本研究以鸡A：vBD7作为研究对象，应用基因工程技术，将人工合成的 pGEx一6P√l馏ID7大肠杆菌工程菌。通过优化表达条件获得大量的可溶性融合蛋 肽具有较好的抗菌活性。具体研究内容和结果如下： 1．构建表达AvBD7成熟肽的大肠杆菌工程菌 AvBD7成熟肽基因序列，设计1对引物P1(5’端含有互泐RI酶切位点)和P2(5’端 含有勋，I酶切位点)用于PCR扩增鸡彳佃D7成熟肽基因片段，把PCR扩增出的 鸡AVBD7成熟肽基因片段和p饼Ⅸ．6P一1载体分别进行双酶切后连接，构建成功 pGEX．6P．】．一AVBD7成熟肽表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)。 2．鸡A：vBD7成熟肽的表达、纯化及鉴定 将测序正确的E SDS．PAGE检测分子量约为31kD。为了提高蛋白的可溶性表达量，经过摸索不 oC mmoL的口TG诱导约24h后可 同的表达条件发现，在16 120吣in经0．1 析、超滤、C18 质谱分析鉴定出蛋白分子量为5516Da此分子量与形成2个二硫键的AvBD7成 熟肽的理论分子量相符。 3．鸡AvBD7成熟肽的抗菌活性分析 采用打孔扩散法检测纯化得到的鸡成熟肽AvBD7对各个指示菌的抑菌情况， 结果发现：纯化得到的鸡成熟肽AvBD7对黄色微球菌(NCIB8166)、金黄色葡萄 球菌(ATCC25923)、粪肠链球菌(ATCC29212)、大肠杆菌(CMCC44102)都有抑 菌活性。但是，鸡B．防御素AvBD7成熟肽对白色念珠菌(ATCC10231)和白色念 珠菌(ATCC 成熟肽(质谱分析鉴定正确)的蛋白浓度，再根据Levengood等人的方法测量纯化 得到的鸡AvBD7成熟肽对不同指示菌的最小抑菌浓度(MIC)，结果显示：对黄色 微球菌(NCm8166)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、粪肠链球菌(ATCC29212)、 大肠杆菌(CMCC44102)的最低抑菌浓度分别为16．875、67．5、67．5、135m∥L；用 纯化得到的高浓度(540 10231)和白色念珠菌(ATCC90029)进行最低抑菌浓度实验发现没有抑菌活性产 生。由此可知，体外条件下纯化得到的鸡B．防御素AvBD7成熟肽只对一些特定 的指示菌具有抑菌活性。 件使融合蛋白GST-AvBD7的可溶性表达量达到最大，对表达纯化得到的重组 AvBD7成熟肽进行质谱分析，再通过琼脂打孔扩散法检测AvBD7成熟肽的体外 抑菌活性和2倍稀释法测定对指示菌的最低抑菌浓度。这些研究结果丰富了我们 对防御素的认识，也为新型饲料添加剂的开发提供了实验数据。 关键词：鸡AvBD7成熟肽，异源表达，质谱鉴定，二硫键，抗菌活性分析 II AbStract AVBD7 isa42一锄inoacidresidueB-def-吼sin the man鹏p印tide produccdby to廿le ofcationicantimicrobial chicken，be】ong 1arge钿nily isa ofiIulatea11d isa of a iInportantcomponellt adaptiVeiInmuIlit)，．n capablekillillg broad of a11dmi