毛细管电泳-激光诱导荧光检测法分析胃癌组织及癌旁正常组织蛋白质的差异性（原版论文）.pdfVIP

· 1006· 色 第 31卷 胃癌是临床常见的恶性肿瘤之一，其发病率居 物 ：Protein MolecularWeightMarker (Broad) 全部恶性肿瘤的第三位 ，列消化道恶性肿瘤 的第一 D532S(TaKaRa公司)；二甲苯为化学纯 ；苏木精染 位 ¨。由于多数 胃癌患者就诊时 已到晚期 ，导致 胃 液 、伊红染液 、1％盐酸乙醇分化液 由本实验室配制。 癌患者的死亡率居高不下 。因此 ，寻找肿瘤早期 1．2 样品采集及苏木精一伊红 (I-IE)染色 诊断的方法成为提高5年存活率和治愈率的重要途 胃癌组织及癌旁正常组织样品取 自兰州军 区兰 径。近年来 ，从蛋 白质 中寻找肿瘤标记物作为肿瘤 州总医院病理科 ，共 40例 80个样本 。其 中男 28 早期诊断的依据逐渐成为肿瘤 学研究关注的新热 例 、女 l2例 ，患者年龄43～71岁，平均年龄 (59±2) 点 。蛋 白质组学发现重大疾病分子标记物 的过 岁。标本来 自胃部切除术并经病理切片证实 ，其 中 程一般是指特异性蛋白质的分离、鉴定与分析 ，及更 高分化腺癌6例 、中分化腺癌 18例、低分化腺癌 15 深层次的分子标记物和药物靶标的发现和验证 。 例 、胃溃疡癌变 1例。HE染色按常规病理染色方 目前蛋 白质组学常用的检测技术包括二维凝胶电泳 法进行 。 (2D—PAGE)、质谱 (MS)等。虽然这些技术分离蛋 1．3 毛细管柱修饰 白质具有较高的灵敏性 ，但如何从繁杂的信息中发 蛋 白质吸附是影响毛细管分离蛋 白质的难题之 现差异蛋白质并从中提取有用的信息，使其成为敏 一 。 目前人们通常采用极端 pH、添加剂 、外加径向 感性和特异性均高的标记物是研究的重点和难点。 电场和聚合物涂层等几种方法来抑制蛋白质在管壁 毛细管电泳 (CE)易与其他分析技术联用 ，从而 的吸附 。本实验对毛细管管壁添加化学涂层 ，并 大大增加了其应用范围，是 目前发展最为迅速的分 采用pH l0的 l×TBE(Tris—borate—EDTA)作为缓 离分析技术之一 。关于毛细管筛分生物大分子 冲液以减少蛋 白质对管壁 的吸附。涂覆步骤按文 的机理已有报道 ’，且毛细管 电泳与激光诱导荧 献… ，具体如下 ：取一段石英毛细管 ，用 0．2mol／L 光检测法 (CE—LIF)联用检测核酸和蛋 白质的技术 NaOH清洗 1h，再分别用水、甲醇 、空气各冲洗 l5 已经成熟 ，比紫外检测的灵敏度高 l0—1000倍 。 min。用 MAPS一甲醇 (1：1，v／v)混合物冲洗毛细管 本实验采用异硫氰酸酯 (FITC)作为柱前衍生试剂 ， lh，室温反应过夜 。分别用甲醇 、水 、空气各冲洗毛 以 Protein Molecular WeightMarker (Broad) 细管 15rain，再用3．4g／L丙烯酰胺单体溶液冲洗 D532S为标准样品，建立了CE—LIF方法 ，对 胃癌组 毛细管 1h，室温反应4h，用水冲洗 20min，即可 织和癌旁正常组织进行分析测定，依据迁移时间和 使用。 峰面积做定性分析。并通过指纹 图谱相似度软件计 1．4 蛋 白质的提取及标记 算 胃癌组织和癌旁正常组织 中蛋 白质 的相似度，比 取 胃癌组织 20mg，充分剪碎 ，置于 Eppendorf 较其差异性 ，为肿瘤蛋白质标记物的寻找提供依据 。 管中，用组织蛋 白质提取试剂盒提取 胃癌组织蛋 白 质 ，置于 一20℃冰箱中保存备用。 l 实验部分