Alcaligenes eutrophus CH34中czcD基因的克隆,表达以及功能的初步研究.pdfVIP

Alcaligenes eutrophus CH34 中czcD 基因的克隆，表 达以及功能的初步研究1 ， ， 1 1 2 * 3 1 1 毛娟 ，谢小冬 ，赵小红 ，蒋凡 ，张华 1 兰州大学生命科学学院，甘肃兰州（730000 ） 2 甘肃省新药临床前研究重点实验室，甘肃兰州（730000 ） 3 北京市生物活性物质与功能食品重点实验室，北京（100083 ） E-mail: maojuan0918@163.com 摘 要：以Alcaligenes eutrophusCH34 质粒为模板， PCR 扩增得到的czcD 基因，与表达载 体pET-28（a+ ）连接，转化E.coilBL21 ，得到转基因菌株PETCZCD 。Alcaligenes eutrophusCH34 质粒消除得到菌株△CH34。 PETCZCD 的质粒转化△CH34 得到转基因菌株JH。将上述不 同菌株PETCZCD ，△CH34 以及阴性对照野生型E.coilBL21 ， Alcaligenes eutrophusCH34 分别置于含不同浓度重金属Co2+ ，Zn2+ ，Cd2+ 的LB 培养基中培养，在培养 10h，13h，15h， 18h，20h ，22h ，24h 时测OD600 ，观察各个菌株的生长情况。结果发现转czcD 基因菌株的 生长速率较对照组快，分析表明 CzcD 蛋白对重金属钴，锌，镉有一定的抗性，并且 CzcD 对不同的重金属产生抗性可能采用了不同的抗性机制。同时，对czcD 基因在E.coilBL21 中 的表达情况进行了初步的研究，结果发现当E.coilBL21 在对数生长的后期时加入 1mmol/L 的IPTG 进行诱导表达，蛋白表达量相对较多。 关键词：Alcaligenes eutrophusCH34 ，czcD ，重金属，质粒消除，转化 中图分类号：Q7 Alcaligenes eutrophus CH34是一种具有重金属抗性的革兰氏阴性细菌[1] 。细菌的质粒上 含有抗重金属镍 [2, 7] [3] [4, 5] [6] [8] [9] ，锌，镉 ，钴 铜 铬酸盐 ，汞的基因 ；染色体上也存在某些 重金属抗性的基因，如：对铬酸盐产生抗性的基因chr2 ，是该菌株对铬产生抗性的主要因素 [10] 。Alcaligenes eutrophusCH34显著的抗重金属特性，使它已经成为一种研究细菌对重金属 产生抗性的模式菌[3] 。对重金属起抗性的部分核心基因已经成为目前国际上研究的热点，包 括对基因序列，蛋白结构以及部分基因的抗重金属的作用机制都有了初步的研究。如在 Alcaligenes eutrophusCH34 中对重金属锌，镉，钴产生抗性作用的CzcCBA离子泵出系统中的 czcC,B,A基因[11] 。而目前对于czcD基因的主要观点是认为CzcD蛋白是CDF家族中的一员， [12] [4] 主要在CzcCBA系统中对重金属抗性起调控作用 ，其对CzcC,B,A的表达是必须的 。但是 对该基因所编码的蛋白本身是否也具有某种程度的重金属抗性，以及如何发挥抗性作用，还 知之甚少。 人们在日常生活无时无刻不在与重金属打交道。餐具，家具，一些劣质化妆品等中都有 一定含量的重金属[13] 。重金属在人体内累积达到一定的浓度会给健康带来极大的危害：一 定浓度的重金属会对人的神经系统造成危害；钴，铬，锌在人体内积累到一定浓度甚至会导 致癌症的发生；高浓度锌能够导致血中高密度脂蛋白下降而促发动脉粥样硬化[14] 。因此对 细菌具有抗重金属特性的基因以及其抗性机制的研究具有一定的科研和应用价值。而以微生 物为手段进行