孕酮对Aβ25-35诱导AD样损伤神经元氨基酸类递质系统影响和机制初探.pdf

中文摘要 孕酮对A132”5诱导的AD样损伤神经元氨基酸类递质系统的影响 和机制初探 摘 要 目的：阿尔采末病(Alzheimer’s disease，AD，又名阿尔茨海默病，早 老性痴呆)是一类以进行性记忆力损伤和认知障碍为主要临床表现的中枢 神经系统退行性病变，是老年痴呆最常见的一种形式。目前的研究认为， 的核心机制。近年的实验研究表明，神经甾体对包括AD在内的神经退行 性疾病的治疗具有重要意义。本实验室前期研究发现，神经甾体孕酮 可通过调节氨基酸类递质系统，降低神经系统的兴奋性，从而起到神经保 护的作用；并且PROG能够浓度依赖的抑制Ap诱导的神经毒性作用，提 高神经元存活率。提示，PROG可能通过调节氨基酸类递质系统的兴奋性 来对抗AB诱导的神经毒性作用，从而改善AD的症状。本研究将SD大 鼠的大脑皮质神经元进行体外原代培养，采用Ap活性片断Ap25．35体外诱 导神经元损伤，用神经甾体PROG处理，采用高效液相色谱．串联质谱 (GABA)的浓度；采用免疫细胞化学法测定神经元氨基酸受体亚单位 对AD样损伤神经元中氨基酸类神经递质释放及其受体表达的影响，进一 供新的思路。 方法： 1 大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及形态观察 取新生SD大鼠大脑皮质，用胰蛋白酶消化并辅以机械分离法分离细 度调整为1．O×109L～，培养板中预先放入包被L．多聚赖氨酸的圆形玻璃 盖玻片并接种细胞，在370(2，5％C02及饱和湿度的细胞培养箱中孵育， 24 中文摘要 养第10天的神经元供实验用。倒置显微镜下观察神经元的形态学变化。 2分组和药物处理方案 2．1 建立Ap25-35致AD样神经元损伤模型 理组(GLU浓度为1 ApM及ApH，终浓度分别为O．1praol·L-1、1哪01．L以及10 lJxn01．L．1)，每 组设6个复孔，加药处理并继续培养24h后，进行神经元形态学观察和 MTT测定。 2．2 PROG处理对hi325-35诱导的AD样神经元损伤的影响 终浓度分别为0．001岬ol·L～、0．01¨rnol·L。和O．1I．tmol·L～，各组同时加 h后， 入模型组浓度的Ap25-35)，每组设6个复孔，加药处理并继续培养24 进行神经元形态学观察和MTT测定。 2．3 实验分组同“2．2”，每组设6个复孔，加药处理并继续培养24h后， 片上的神经元用免疫细胞化学法测定NR2B、GBR2受体亚单位表达。 3 MTr法检测细胞存活率 将细胞接种于24孔板，培养第lO天，加药处理完后，每孔加入80止 mmol·L。)，37℃继续孵育4 MTT液(3．6 h，弃上清，加入300止DMSO nnl波长处的 溶解甲瓒结晶，以空白孔调零，用紫外分光光度计测定570 吸光度值，设空白对照组吸光度的均值为100％，以各样本吸光度值／空 白对照组吸光度的均值为该样本的细胞存活率。 4 HPLC．MS／MS法测定细胞培养液中GLU和GABA的浓度 m1甲醇涡旋震荡3min， 取细胞培养液lml置lOml离心管中，加入3 离心(3000 minx50 n吼， 中文摘要 kV；鞘气压力(Sheath ESI源，正离子检测；喷雾电压(SprayV