油茶CoSAD基因载体的构建、鉴定及功能分析.pdfVIP

植物资源与环境学报,2015,24(2):11-18 Journal of Plant Resources and Environment 油茶 CoSAD基因载体的构建、鉴定及功能分析 1 2,① 1 2 2 陈鸿鹏 ,谭晓风 ,谢耀坚 ,张党权 , 曾艳玲 (1. 国家林业局桉树研究开发中心,广东 湛江524022;2. 中南林业科技大学,湖南 长沙410004) 摘要:为揭示油茶(Camellia oleifera Abel)硬脂酰-ACP脱饱和酶(SAD)基因(即CoSAD基因)的功能,构建了该基 因的原核表达载体pET28b-CoSAD、植物表达载体pBI121-CoSAD和RNA干扰载体pBI121-CoSAD RNAi,并采用 PCR扩增及双酶切方法对3类载体进行鉴定;在此基础上,对原核表达载体中的CoSAD基因进行诱导表达分析,并 对pBI121-CoSAD转化的拟南芥〔Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.〕sad突变体植株和pBI121-CoSAD RNAi转化 的拟南芥野生型植株进行转基因鉴定和主要脂肪酸成分含量分析。 PCR 扩增和双酶切结果显示:从 pET28b- CoSAD、pBI121-CoSAD和pBI121-CoSAD RNAi 载体的阳性克隆中均可获得目的条带,表明这3类载体均构建成 -1 功;用1mmol ·L IPTG分别诱导0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 和5.0 h,CoSAD基因均能够在pET28b-CoSAD转化的大 肠杆菌BL21感受态细胞中正常表达,能够获得与预测结果相符的相对分子质量约47000 的特异目的蛋白条带,且 蛋白活性随诱导时间的延长而升高。 从pBI121-CoSAD转化的拟南芥突变体植株和pBI121-CoSAD RNAi转化的 拟南芥野生型植株中也均可扩增出目的条带。 GC-MS分析结果显示:与拟南芥野生型植株相比,其突变体植株的 硬脂酸和棕榈酸含量较高、油酸和棕榈油酸含量较低;但突变体植株经pBI121-CoSAD转化后,硬脂酸和棕榈酸含 量降低而油酸和棕榈油酸含量提高;野生型植株经过pBI121-CoSAD RNAi转化后,硬脂酸和棕榈酸含量提高、油酸 和棕榈油酸含量降低,表明pBI121-CoSAD转化能够促进拟南芥sad突变体植株体内饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸 转化,而pBI121-CoSAD RNAi转化对拟南芥SAD基因的表达有明显的抑制作用,这2种重组质粒均可影响拟南芥 植株的脂肪酸含量。 研究结果表明:油茶CoSAD基因具有调控饱和脂肪酸(硬脂酸和棕榈酸)向不饱和脂肪酸(油 酸和棕榈油酸)转化的功能,对茶油的脂肪酸组成具有关键的调控作用。 关键词:油茶SAD基因(CoSAD基因);原核表达载体;植物表达载体;RNA干扰载体;脂肪酸组成;调控功能 + 中图分类号:Q344 .13;S565.9 文献标志码:A 文章编号:1674-7895(2015)02-0011-08 DOI:10.3969/ j.issn.1674-7895.2015.02.02 Construction,identificationandfunctionanalysisonvectorsofCoSAD genefromCamelliaoleifera 1 2,① 1 2 2 CHEN Hongpeng ,TAN Xiaofeng ,XIE Yaojian ,ZHANG Dangquan ,ZENG Yanling (1. China Eucalypt Research Centre, Zhanjiang 524022, China; 2. Central South University of Forestry and