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摘要 产甲基丙二酰辅酶A假单胞菌的构建和雷帕霉素生物合成基因簇的 定位 摘要 微生物次级代谢产物的研究与开发明显受益于异源表达系统的应用，通过把 来源于原始菌株的生物合成基因导入合适的新宿主菌株中，可以更容易地进行基 因操作，研究沉默基因的功能和设计新的化合物，可以解决原始菌株难培养的问 题以提高次级代谢物的产量，而且由于宿主菌比较清晰的代谢背景可以简化次级 代谢产物的提取工艺等。目前，微生物复杂次级代谢产物的多酶复合体基因异源 表达方面研究最为深入的是聚酮类化合物。 聚酮化合物成功地异源表达需要一个合适的宿主菌，假单胞菌 操作系统，有适合聚酮化合物异源表达的修饰系统等优势成为聚酮化合物异源表 达的首选宿主之一。相当多的聚酮化合物的合成需要以甲基丙二酰辅酶A 此本研究通过基因工程的方法构建能产生mmCoA的假单胞工程菌。在微生物中 mmCoA可以通过两条途径合成，一个是PCC途径，由丙酰基辅酶A羧化酶催化 丙酰基辅酶A生成；另一个是MCM途径，琥珀酰辅酶A由甲基丙二酰辅酶A变位 酶和差向异构酶催化生成。 在本研究中利用两种途径来产生mmCoA，PCC途径由来源于天蓝色链霉菌 (S 基辅酶A羧化酶p亚单元羧基转移酶的pc扭基因组成；来源于恶臭假单胞菌 KT2440(Pseudomonasputida 源于pACYCl77的kan基因(卡那霉素抗性基因)，以上五个基因构建成顺序为 上构建成整合质粒，通过三亲杂交的方法把基因盒整合到P KT2440基因 putida LS．PCC：MCM基因簇由来源于Ecoli的 组中，得到双交换子，命名为只putida 编码甲基丙二酰辅酶A变位酶sbm基因，编码甲基丙二酰辅酶A变位酶复合物保护 组成，用同样的方法扩增kan基因和同源区域，共六个基因组成 putida LS．MCM。 KT2440基因组中得到双交换子命名为P putida 气相色谱和质谱连用分析表明P LS．MCM均能 putidaLS—PCC和户putida nmol／mL和2．22nmol／mL。 产生mmCoA，产量分别达2．49 摘要 环内酯类聚酮化合物，具有免疫抑制作用，1999年正式作为免疫抑制剂药物使用， 除此之外它还具有抗真菌，抗肿瘤活性，最近的研究发现雷帕霉素具有延长小鼠、 酵母、线虫、果蝇寿命，还可一定的恢复患有阿尔茨海默类似症状实验小鼠的学 习记忆能力，因此雷帕霉素及其类似物是一类具有药用潜力的化合物。雷帕霉素 原始生产菌株基因操作困难、产雷帕霉素能力低下、发酵周期长及高浓度产物和 底物抑制等问题制约着雷帕霉素的研究开发，因此异源表达雷帕霉素是很有必要 107-3 kb，其中聚酮合酶(PKS)基因约80 kb，包含3个大的开放阅读框(rapA、 rapB、rapC)，在PKS基因两侧有24个编码框，主要编码雷帕霉素后修饰和合成 中一些关键步骤所需的酶。 基因组，利用脉冲场凝胶电泳分离酶切的片段，以特异性的rapP基因片段作为探 针通过Southern杂交在凝胶上定位含有完整生物合成基因簇的片段，确定基因 簇存在于两个相距约360kb的Ⅺ斌酶切位点之间。并设计了克隆雷帕霉素生物 合成基因簇的Red／ET重组策略，为通过ET重组克隆完整生物合成基因簇进而实 现异源表达提供了一种方法。 关键词：假单胞菌，甲基丙二酰辅酶A，异源表达，雷帕霉素生物