新型免疫毒素mST的表达、纯化及细胞毒性分析.pdf

新型免疫毒素reST的 表达、纯化及细胞毒性分析 硕士研究生：蔡华伟 导 师：卢晓风 中文摘要 免疫毒素因具有细胞选择性杀伤活性而在一些疾病治疗中显示出广 阔的应用前景。免疫毒素通常由识别片段和杀伤片段组成，识别片段决 定分子对细胞的选择识别特性，杀伤片段决定分子的杀伤效率和作用方 式【l】。活化T细胞是介导移植排斥的重要细胞，选择性清除活化T细胞 可能减轻移植排斥反应。活化T细胞表面诱导性表达T淋巴细胞相关毒 片段，融合能够作用于细胞膜的通道形成杀伤片段，构建的免疫毒素可 能选择性清除活化T细胞，具有被开发为新的免疫抑制剂的潜力。 根据这一设想，本研究分别选择了抗小鼠cTLA-4单链抗体mS和 能在真菌细胞膜上打孔的抗真菌肽T为识别片段和杀伤片段，设计了表 观分子量大约为34kD的新型免疫毒素reST；通过基因工程手段，先后 在原核大肠杆菌和真核毕赤酵母系统中进行表达；进而分离纯化重组蛋 白，并对其细胞杀伤活性进行了初步分析。结果发现： 件下，经O．1 亲和层析，可以获得少量的可溶性mST蛋白；多数mST蛋白以不可溶 的包涵体形式表达，包涵体沉淀用6M盐酸胍进行溶解，然后在8M尿 素存在的情况下经Ni．NTA分离纯化，可获得大量reST包涵体蛋白；在 4。C，50raM M M mM Tris-HCl，lUrea，0．8 GSH，0．2 L-Arginine，2 四纠友坐亟±监塞 mM GSSH，pH8．0条件下透析复性48h，约70％包涵体蛋白可以被复性， 但是，在去除复性液中残留变性剂的过程中，蛋白损失较大，最终蛋白 浓度大约只有O．1mg／ml左右。 2)由于包涵体蛋白复性困难，重复性差，因此本论文迸一步选择能 够分泌表达重组蛋白的真核毕赤酵母体系对mST进行表达。将mST基 因插入pPIC9K后再通过电穿孔转入毕赤酵母GSll5，长出的单克隆经3 获得0．1mg目的蛋白。 3)活性分析发现，从大肠杆菌细胞质内分离纯化的可溶mST在0．5， 1和2uM浓度下，对小鼠淋巴瘤细胞(EL4)的杀伤率分别为360／扯11．2％， 440／o_+3．8％，64％：t：9．1％；从包涵体复性获得的mST在O．5，l和2uM浓 毕赤酵母表达体系中获得的reST在luM浓度下对EL4的杀伤率为 37．5％垃．2％。而单链抗体mS在这些浓度下对EL4没有明显杀伤作用。 上述结果表明，mST在大肠杆菌中以可溶和包涵体形式表达，但主 要为不具活性的包涵体；在毕赤酵母PIC9K体系中以可溶蛋白形式表达， 但产量不高，大约每升诱导培养基可获得lmg蛋白；活性分析发现，不 同来源的mST对EL4细胞均表现了一定的杀伤，表明该免疫毒素的设计 是可行的。在今后的工作中，尚需进一步优化mST的表达条件，获取大 量的蛋白，对其体内外细胞杀伤活性及特异性进行研究，确定其抗移植 物排斥效果及作为新型免疫抑制剂的可能性。 关键词： 免疫毒素；免疫抑制剂；单链抗体；CTLA4；大肠杆菌表达系 统；毕赤酵母表达系统；细胞毒性 and Expression，Purification Cytotoxicity of Novel lmmunotoxinmST 舰s．Candidate：Cai Huawei LH Supervisor．- Xiaofeng Abstract： Immunotoxinsh