人羊膜上皮细胞移植治疗阿尔茨海默病的实验的研究.pdfVIP

摘要 人羊膜上皮细胞移植治疗阿尔茨海默病的实验研究 研究生： 闫飞 导师： 鄢文海 李国栋 郑州大学基础医学院病理生理学教研室 郑州450052 摘要 amniotic 人羊膜上皮细胞(human cells，hAEC)属于问充质干细胞 epithelial 的一种，来源于胎盘羊膜组织，表达干细胞标志分子及相关基因，但不表达端 粒酶基因，具有非致瘤性，细胞表面不表达MHC．II类抗原，少量表达MHC． I类抗原，同时还可分泌免疫抑制因子，防止移植后炎性反应的发生，因此可 以看作是免疫赦免细胞。同时人羊膜上皮细胞具有明显的可塑性和多向分化潜 能，在不同生长因子的调节下，可分化为肝样细胞、心肌样细胞和胰岛样细胞 等，也可分化为神经胶质细胞、神经元细胞等；同时，羊膜于胎儿出生后是无 用组织，取材方便，来源广泛，有足够量的组织用于细胞培养及定向诱导分化，且羊 膜上皮细胞在体外表现为极强的细胞增殖能力，可以为临床移植提供充足的细 胞来源。目前，使用羊膜组织细胞已成功应用于烧伤科和眼科治疗皮肤、角膜 烧伤，同时，在帕金森病(PD)、缺血性脑损伤、脊髓损伤等疾病中的应用已经 开始试验性研究，这为羊膜上皮细胞应用于AD的治疗提供了理论和实验依据。 阿尔茨海默病(AD)是神经系统变性疾病之一，其特征性病理学改变为大脑皮 质神经细胞内神经原纤维缠结(NFT)、细胞外大量老年斑(sP)形成、胆碱能神 经元变性，导致大脑皮质胆碱能神经细胞减少，乙酰胆碱(Ach)等必需神经递 质减少，临床上表现不可逆进行性发展的记忆减退，认知功能障碍等。也有研究 摘要 发现，在AD的发病过程中有很多因素参与，包括单胺类神经递质组胺(HA)、 5．羟色胺(5．HT)等，它们在脑内含量发生改变共同参与了AD的病理过程。 因此，本实验将人羊膜上皮细胞植入阿尔茨海默病模型小鼠(APP转基因 鼠)脑内，监测植入细胞的存活与迁移情况，观察模型鼠行为学(学习、记忆 功能)改善情况，检测脑内Ach、HA、5．HT量的改变，探讨羊膜上皮细胞植入 治疗阿尔茨海默病可行性及可能的机制，为AD的治疗提供理论和实验依据。 方法 协和医科大学购进APP转基因小鼠进行繁殖，全部新生小鼠均进行APP基 因表达的检测；免疫组织化学方法检测12月龄小鼠脑内APP蛋白、老年斑(SP) 小鼠10只)和假手术组(APP．小鼠10只)。 妇产科取健康待产妇剖腹产胎盘，无菌条件下分离羊膜组织，剪碎，胰酶、 胶原酶消化，密度梯度离心法分离人羊膜上皮细胞(hAEC)，光学显微镜下计 数，接种于含15％胎牛血清的DMEM培养液中(T-50培养瓶)培养；经过传代 7砌Z)； 纯化，第三代细胞采用BrdU标记，收集BrdU标记好的hAEC(终浓度1×10 异戊巴比妥那麻醉小鼠，立体定位仪固定，微量注射器向小鼠侧脑室注入收集 照。 移植后第8周，Morris水迷宫检测小鼠行为学指标，免疫组织化学方法观察 移植细胞在模型小鼠脑内的存活、迁移和分化情况，高效液相色谱分析法检测 小鼠脑内神经递质HA、5-HT、Ach量的变化。 结果 APP基因检测显示，大部分繁殖后代小鼠表达阳性；12月龄小鼠海马和皮 层APP蛋白增多，出现AD典型的病变特征一老年斑(SP)，表明所选动物模型 成功；人羊膜经胰酶、胶原酶消化后，密度梯度离心得hAEC呈圆形，培养7 天贴壁生长，15天左右出现细胞克隆，细胞呈多角形、铺路石样，间杂有成纤 维样细胞，经传代纯化培养，第3代细胞呈单一形态生长。 BrdU标记后的hAEC采用立体定位注射法植入模型鼠(12月龄)侧脑室， 移植后第8周在海马及皮层均能检测到散在分布的BrdU表达阳性细胞，说明移