玉米C4途径关键酶PEPC、PPDK基因的克隆及其PEPC基因对小麦的遗传转化.pdfVIP

摘 要 小麦为我国的重要粮食作物，其生产能力及供需状况始终关系到我国国民经济发展和粮 食安全等重大战略问题。随着我国社会经济的发展和人口的增加，人们对于粮食的需求日益 增长。光合作用是一切绿色植物物质生产的基础，因此，提高作物产量的关键是提高光能利 用效率，从而提高单位面积的产量。C4植物如玉米、高粱、甘蔗等具有C02浓缩机制，光 补偿点高，C02补偿点低，光呼吸弱，特别在高温、干旱等逆境条件下，比C3植物小麦、 水稻等有较高的光合效率。将C4途径关键酶基因引入C3植物以提高其光合效率和籽粒产量， 一直是国内外生物学研究领域的前沿问题。 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是C4光合途径中的关键酶，其主要分布在c4植物的 叶肉细胞的细胞质内，形成C02的浓缩机制为维管束鞘细胞的C3途径提供C02，起“C02泵” 的作用。磷酸丙酮酸二激酶(PPDK)催化的反应是C4代谢途径中的限速步骤，是c4光合途 径过程中另一个备受关注的酶，此酶位于叶肉细胞的叶绿体中，催化C02最初受体PEP的再 生。许多研究已表明，将C4型pP弦基因转A．C3作物可以提高C3作物的光合效率和产量潜力。 为获得具有C4光合特征的高光效转基因小麦新品系，我们从光合效率和PEPC酶活性 法将玉米C。型pepc基因导入到小麦中，为提高小麦品种的光合效率和转基因高光效育种提 供必要的理论和技术材料支撑。主要结果如下： 1．利用同源克隆技术，从玉米中克隆了C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因 99％。核苷酸序列中存在16处碱基差异，导致蛋白质水平上有5处非连续性排列的氨基酸 差异，并未影响到该酶的酶活性。编码区核苷酸序列与甘蔗c4型、高粱C4型、谷子C4型 同源率分别达到91％、90．2％、83．2％，与水稻C3型、高粱C3型、谷子C3型、稗草C3型同 源率分别为74．1％、75．1％、76．8％、75．7％。氨基酸序列进化树分析表明，所克隆的玉米C4 型PEPC与甘蔗和高粱的c4型遗传距离最近，而与谷子C4型次之。编码蛋白质的功能位点 分析表明，玉米PEPC蛋白质氨基酸序列有7个保守区。 2．利用同源克隆技术，从玉米中克隆了C4型磷酸丙酮酸二激酶(PPDK)基因的cDNA。 与已登陆的玉米ppdk基因(J03901)相比，序列同源性可达92．94％， eDNA序列插入双元表达载体 号为FJ415327)构建高效双元表达载体。将玉米C4型PEPC pCAMBIA3301中，构建了p3301．pepc融合表达载体。 4．利用基因枪介导法将p3301．pepc高效表达载体导入6个小麦品种(系)中，共获得 型pepc基因已整合到小麦基因组中。利用实时荧光定量PCR方法分析转基因小麦植株的拷 贝数，在15株转基因植株中7株拷贝数为l，3株拷贝数为2，2株拷贝数为3，拷贝数为5、 8和17的分别为1株。RT-PCR分析结果表明外源基因在小麦基因组中得到正确转录，且不 同转基因植株pepc基因的表达量存在较大差异。 5．对T1代转基因小麦植株进行PCR检测和遗传分析，结果表明大部分转基因植株的 分离比例符合孟德尔显性单基因遗传分离规律，外源基因在T0代转基因植株中整合情况良 好，而且能够稳定的遗传给后代；对T1代部分转基因植株进行PEPC酶活性测定，结果显 示部分转基因植株的PEPC酶活性得到了提高，最高的酶活性是对照植株的2．17倍， SDS．PAGE凝胶电泳分析结果表明不同转基因植株间pepc基因表达水平存在差异，酶活性 较高的转基因植株，其pepc基因表达水平亦高；对田间种植的T1代转基因小麦植株和对照 植株进行叶片净光合速率测定，结果显示，与对照植株相比，除个别Tl代转基因小麦植株 净光合速率与对照差异不明显，大部分转基因小麦植株的光合速率得到明显提高，最高值达 达值，为高光效转基因小麦新品种的选育、小麦高光效转基因育种理论与方法的研究工作提 供了重要材料。 关键词：小麦；玉米；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)：丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)； 基因克隆；转基因植株；光合速率 Ⅱ CLONGoFPHoToSYNTHESISKEYENZYME C4 FRoMMAIZEANDPEPC