唐鱼二种不同长度βactin基因启动调控序列的分离及转录驱动活性的比较分析.pdfVIP

上海水产大学硕士论文 唐鱼二种不同长度13-actin基因启动调控序列 的分离及其转录驱动活-胜的比较分析 摘要 B肌动蛋白(B．actin)基因为管家基因，其启动子具有广泛启动表达功能。B．actin 启动子具有与SV40早期启动子相当甚至更强的启动转录活性，因此成为转基因 albonubes Hn)是我国特有的小型鲤 研究的重要启动子之一。唐鱼(Tanichthys 科鱼类，具有较高的观赏价值。本实验分离了二种不同长度的唐鱼B．actin启动子 序列，分别构建了红色荧光蛋白表达载体，同时利用转基因技术，检测比较二种 启动调控序列的转录启动功能，以期获得具有强启动功能的唐鱼B．actin启动子， 为唐鱼的自源功能基因转化打下基础，同时获得具有更高观赏价值的转红色荧光 蛋白基因唐鱼。主要研究内容如下： 1．利用高保真PCR技术克隆了唐鱼、斑马鱼(Daniorerio)和尼罗罗非鱼 (Oreochromisniloticus)B．actin基因的5’端侧翼区启动调控区及部分开放阅读框。 一个不翻译的外显子和第一个内含子。BLAST结果显示，此开放阅读框片段所 编码的30个氨基酸具有高度的保守性，其中唐鱼与斑马鱼的同源性为100％；与 尼罗罗非鱼的同源性为96．7％。在5’端的非翻译区含有与大多数鱼类相同的与转 box、CArG 录密切相关的几个转录元件：CAAT box和TATAbox，其位置分别 在转录起始位点(+1)上游的．89，．59，．26处左右。 2．通过基因重组，将所获得的唐鱼和斑马鱼B-actin基因启动子定向克隆到不 含启动子的红色荧光蛋白(RFP)表达载体pDsRed2．1的多克隆位点上，分别构 达载体分别注射到唐鱼的受精卵中，利用荧光显微镜观察外源基因RFP在唐鱼 中的表达。结果表明RFP在转pTA-DsRed基因唐鱼表达的阳性率较高，平均为 36．4％，且RFP的表达水平较高，有些孵化出膜72h的仔鱼整个躯干都可见红色 上海水产大学硕士论文 低，其阳性率平均为16．9％，极显著低于转pTA-DsRed基因唐鱼(PO．01)。 blot等技术对肉眼可见红色荧光的2尾 3．采用PCR、RToPCR以及Southern 4月龄转pTA-DsRed基因唐鱼外源基因的整合和表达情况进行了检测。转基因唐 鱼眼、肌、鳍及内脏等的基因组DNA进行RFP基因的PCR扩增及扩增产物的 Southernblot检测，结果在所检测的组织器官中均能检测到RFP基因；而采用 的表达，另一个体在除鳍外的其他组织器官也均有表达；Southemblot检测肌肉 组织基因组DNA显示有比阳性载体分子大的杂交条带，未检测到小分子杂交 带。实验表明在所检测的组织中已发生外源基因RFP的整合，但在有些组织中 存在表达水平较低或者不表达的现象。 4．应用基因组步移(Genome 基因启动子序列，进一步分离到唐鱼8-actin基因5’侧翼长为1．7kb的远端启动 子序列，最终获得总长度为3．0kb的唐鱼6-actin基因启动调控序列。将其定向克 pTLA—DsRed，采用显微注射法将线性化的重组表达载体注射到唐鱼的受精卵中， 利用荧光显微镜观察外源基因RFP在唐鱼中的表达。结果显示RFP在转 pTLA．DsRed基因唐鱼表达的阳性率较高，平均为35．1％，在有些刚出膜的转 pTLA．DsRed基因唐鱼体表肉眼即可观察到红色荧光，在荧光显微镜下整个体表 kb的启 中RFP的表达量比转pTA-DsRed唐鱼的高35．7％。实验显示长度为3．0 5’ 动调控序列具有更强的驱动外源基因在唐鱼体内表达的活性，推测唐鱼B．actin 远端启动子序列中存在着转录的正调控元件。