广州管圆线虫寄生基因及其分子鉴定的研究.pdfVIP

摘要 摘要 广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)幼虫可入侵人体并停留在中枢神 经系统，引起嗜酸粒细胞增多性脑膜脑炎。广州管圆线虫病作为一种新发的传染 病正受到越来越多的重视，其许多生物学特性尤其是分子生物学方面的特性还未 被认知。因此，寻找广州管圆线虫与宿主相互作用的抗原或过敏原及其功能蛋白， 对广州管圆线虫病的预防和治疗有重要意义。本研究从GenBank下载1277条 V3．0 广州管圆线虫的表达序列标签(EST)，用BlastX比对分析，并用SignalP 预测潜在的抗原或过敏原相关蛋白N端是否具有分泌信号肽或信号锚定肽。结 果显示，得分值大于80有695条，其中14条与广州管圆线虫一致，540条与 其他物种的相关蛋白相匹配，60条与数据库中序列无同源性。614条序列可分 为lO类，抗原或过敏原相关蛋白有80条，编码22种蛋白，其中12种具有 分泌信号肽，3种具有信号锚定肽。 半胱氨酸蛋白酶(eysteineprotease)是许多寄生虫新陈代谢必不可少的，在 宿主致病、免疫逃避和组织入侵中都起着重要作用。本研究中通过生物信息学手 段在广州管圆线虫EST库中发现三种半胱氨酸蛋白酶家族基因：组织蛋白酶B hem)，分别根据其EST签设计特异引物，通过eDNA末端快速扩增(RACE) 技术分别扩增5’和3’端序列，得到基因全长。用生物信息学的方法对三种半胱 氨酸蛋白酶样基因进行分析。根据基因全长设计特异引物，对其编码区进行扩增， I和Sal 产物经rvn l双酶切，克隆至表达载体pET32a(+)，转化至大肠埃希菌 (Escherichia 编码394aa，具有分泌信号；AC-cathB-2蛋白也有信号肽，成熟肽由330个氨基 AC-cathB-2和AC-hem均有抗原性。 进一步研究以上三种半胱氨酸蛋白酶在广州管圆线虫Ll，L3期幼虫和成虫 中的表达差异，我们进行了实时荧光定量PCR(Real-TunePCR)实验。结果显 摘要 L1期幼虫中相对表达量最高，在L3期幼虫体内AC-cathB-2相对表达量最高， 在雌成虫和雄成虫体内，分别是AC-cathB．1和AC-hem表达量最高。同一基因在 不同发育期的表达量显示，AC-cathB-1和AC-hem基因在发育过程中表达量逐渐 增加，而AC-cathB-2在L3期幼虫体内表达量最高，发育成成虫后表达量明显减 的发育。 为了快速准确的鉴定鼠类寄生虫，我们针对鼠类常见的三种寄生虫：广州管 圆线虫、长膜壳绦虫和短膜壳绦虫，设计了三对特异引物。通过PCR反应，这 三对引物均能准确的鉴定三种寄生虫，而且该引物也能在广州管圆线阳性大鼠粪 便里面检测出广州管圆线虫，为在野外调查广州管圆线虫的感染情况提供了一个 新的方法。 PCR。 关键词：广州管圆线虫；半胱氨酸蛋白酶；Real-Time Ⅱ Abstract Abstract Theinfective cantonensisCall third-stageiarve(L3)ofAngiostrongylus orally infecthumanandarecarriedinthebloodtothecentralnervous systerm，which caused hasattractedmoreandmore eosinophilicmeningitis．NowAngiostrongyliasis attention．Westillknowlittleaboutthe cantonensisin ver