《HBD的N端融合蛋白的跨膜转导作用.》.pdf

华 东 理 大 学 学 报 (自然 科 学 版 ) Vo1．40NO．2 176 JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology (NaturalScienceEdition) 2014 04 文章编号：1006-3080(2014)02—0176—06 HBD的N端融合蛋 白的跨膜转导作用 杜 璇 ， 顾红艳 ， 李亚丹 ， 吴 珍 ， 赵 健 (1．华东理工大学生物反应器工程 国家重点实验室，上海 200237； 2．浙江 日升昌药业有限公司，浙江 东阳 322100) 摘要 ：研 究人源性穿膜肽 HBD的N 端融合蛋 白的跨膜转导作用。通过 DNA 重组技术将 HBD融合在 EGFP蛋 白的氨基端(N 端)，构建重组质粒 pET28b—HBD—EGFP—Histag，经 IPTG诱 导表达和 Ni抖一NTA纯化，获得重组蛋 白HBD—EGFP。通过激光共聚焦显微镜定性观察及流式细 胞仪定量检测发现，融合在 EGFP氨基端的 HBD跨膜转导效率 比融合在 EGFP羧基端 (C端)的 HBD转导效率提 高了约 l0倍 。实验结果表 明，N 端融合的 HBDEGFP对于外源蛋 白具有跨膜 运输效果，且比C端融合的HBD具有更高的跨膜转导效率。该结果可为 HBD在抗癌药物递送方 面的有效应用提供理论依据 。 关键词 ：穿膜肽；肝素结合域；HeLa细胞 ；EGFP的N 端 中图分类号：Q71 文献标志码 ：A TransmembraneActivityofHeparin-BindingDomain Fused atN—Term inalofHeterologousProtein DUXuan ， GUHong—yan ， LIYa—dan ， WU Zhen。， ZHAOJian (1．StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering，EastChinaUniversityof Scienceand Technology，Shanghai200237，China； 2．ZhejiangReachallPharmaceuticalCo．Ltd，Dongyang322100，Zhejiang，China) Abstract：To study the transmembraneactivity ofHeparin—Binding Domain (HBD) derived from humanfusedatN—terminalofheterologousprotein，theexpression plasmidpET28b—HBD—EGFP—Histag wasconstructed by genetically fusing HBD to theN—terminalofenhanced green fluorescentprotein (EGFP)． The fusion protein HBD—EGFP wasexpressed in E．coliand purifiedbyNi”一NTA affinity chromatography．Theresults show thatgreen fluorescencecan beobserved in HeIa cellsusing laser scanningconfocalmicroscopewhenHeLacellswereCO—culturedwithHBD-EGFP．Flow—cytometryresults show thatthetransmembraneefficiency ofHBD fusedattheN—terminalofEGFP iSimprovedabout10 timescompared with theHBD fused attheC—term inalofEGFP．TheseresultsdemonstratedthatHBD fusedt