人骨肉瘤细胞特异性结合肽筛选及验证.pdf

人骨肉瘤细胞特异性结合肽的 筛选及验证 硕士研究生：卢坤 指导教师：史占军教授 摘要 骨肉瘤是青少年最常见的原发性恶性肿瘤，占原发恶性骨肿瘤的22．36％。 目前对骨肉瘤的治疗主要包括手术治疗和药物化疗。手术治疗结合辅助放化疗， 患者五年生存率为60％．80％。大约80％的患者在诊断时已有远处转移，手术很 难将原发灶与转移灶完全切除，预后差。由于化疗药物缺乏靶向性，而且，化 疗药物使用剂量普遍偏大，往往对患者机体其它组织或器官正常细胞存在造成 严重的毒副作用。尽管新辅助化疗的概念已经普遍被接受，但是其实施过程多 以探索和摸索的方式进行，肿瘤组织对化疗药物的敏感性存在很大差异，导致 大剂量化疗药物仅对部分患者有较好的治疗效果，对许多患者的身心造成巨大 创伤。化疗药物靶向性差成为亟待解决的一个重要问题。 靶向治疗通过定向结合和特异性杀灭肿瘤细胞，可避免大剂量静脉给药造 成的全身性毒副作用，为骨肉瘤的治疗提供一种高效低毒的全新思路。寻找肿 瘤组织靶向位点或者靶向载体成为重要课题，作为骨肉瘤靶向治疗的一项探索 性研究，本实验试图通过筛选能够与人骨肉瘤细胞特异性结合的短肽，以短肽 作为靶向载体，期待未来以短肽结合化疗药物的模式，将化疗药物定向导入骨 肉瘤细胞，为实现骨肉瘤的靶向治疗奠定基础。寻找肿瘤特异性分子或受体显 得尤为重要。为了获取能与上述靶点特异性结合的配体，必须具备有效的筛选 手段。噬菌体展示技术的应用为实现此目的提供了一个全新有效的工具。 噬菌体展现技术最早由SmithGP等建立。这项技术是20世纪90年代发展 I 中文摘要 起来并得到广泛应用的新技术，基本原理是将编码外源蛋白或多肽的基因片段 插入编码噬菌体外壳蛋白的基因中，使外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合 表达在噬菌体表面，而不影响噬菌体的侵染和扩增能力。其主要特点是将特定 分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，把抗原分子的结合特性与噬茵体 的可扩增性统一起来，成为一种高效的筛选体系。该技术最简单的淘选程序是 将噬菌体展示肽库与包被有靶分子的平板共同温育后，洗去未结合噬菌体，再 洗脱特异性结合的噬菌体；洗脱出的噬菌体扩增后再进行下一轮的淘选。经3q 轮淘选后，特异性结合的噬茵体得以富集。该技术具有操作简单，高通量等特 点，在生命科学许多领域中得到了极其广泛的应用，成为了寻找和开发新的特 异性靶向肽的强有力工具。 细胞作为一个复杂的生物体系，其表面分布着大量的信号分子，可反映细 胞所处的功能状态与特殊功能。尽管理论上我们可将这些分了纯化作为靶标来 筛选细胞的特异性结合肽，但由于细胞表面信号分子数量巨大，纯化这些分子 相当困难，实际上难于完成。完整细胞筛选技术不需事先知道受体的有关信息， 直接筛选某种特定状态下差异分子的表达，细胞表面受体的完整构象及生物学 活性得到良好的保持，达到充分模拟自然条件下蛋白质分子间的相互作用的效 果，有利于寻找到特异性结合于细胞表面的标志蛋白及某种细胞所特有的标志。 但是，完整细胞膜表面抗原分布相对很低，抗体筛选存在一定难度，另外全细 胞筛选仍有非特异性大、背景值高、洗涤过程中特异性配体损失等不利因素， 难于获得针对某一抗原的单链抗体。 为了解决这些问题，并且尽可能接近体内环境，我们在本研究中选用 Giordano等于2001年新建立的用于全细胞差减筛选的“生物淘筛和对筛选出的 反应配体的快速分析(BRASIL)”技术来筛选人骨肉瘤细胞MG63特异性结合 肽。BRASIL技术的基本原理是将噬菌体肽库与差减细胞(本实验选用人胚肾细 胞293T)孵育后，置于有机相上层进行离心，将留在上层水相中的未结合噬菌 体进一步与人骨肉瘤细胞进行孵育，并再次置于有机相上层进行离心，与人骨 肉瘤细胞结合的噬菌体通过离心力的作用进入有机相，这些结合的噬菌体再经 ll 硕士学位论文 过转染、扩增后测定滴度，进行下一轮筛选。 与传统的噬菌体筛选方式相比，一步有机相离心分离技术利用特殊有机溶 剂的配比(常用“邻苯二甲酸二丁酯：环