慢病毒转染HCN4基因构建生物起搏细胞的体外的研究.pdf

慢病毒转染HCN4基因构建生物起搏细胞的体外研究 慢病毒转染HCN4基因构建生物起搏细胞的体外研究 中文提要 背景：植入电子起搏器已成为治疗症状性缓慢性心律失常的首选方法，并取得很 大的成功。然而，有限的电池寿命、缺乏对神经激素自动反应性、儿童期植入起搏器 后电极不能随身体的发育而相应变长等缺点使得人们迫切需要一种更理想的治疗方 法。国内外的学者研究认为利用基因治疗和细胞治疗构建生物起搏在不久的将来可能 会成为电子起搏器最为理想的替代方法。然而目前有关生物起搏的体内实验都没有超 过2周，这是否与目前研究者所选用的基因以及基因载体有关?慢病毒表达系统因其 基因组可以整合于宿主基因组中，长时间、稳定表达外源基因并具有较低的免疫原性， 受到广泛关注。所以本实验我们使用5．aza(5．氮胞苷)诱导骨髓干细胞向心肌样细 胞转化，同时将HCN4(hyperpolarization-activatedcyclic 活环核苷酸门控)起搏基因使用慢病毒转染进心肌样骨髓基质干细胞，观察在体外能 否构建生物起搏细胞，并能长期表达，从而为进一步在体研究生物起搏打下基础。 第一部分猪骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、培养及5．a髓诱导其转化 为心肌样细胞的研究 第一节猪骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、培养 目的：建立猪骨髓间充质干细胞体外培养方法，为5-aza诱导转化为心肌样细胞 提供材料。 方法：猪的骨髓MSCs分离纯化后，流式细胞仪检测细胞周期。 结果：体外培养的原代MSCslO～14d达到融合，细胞周期显示73％的细胞处于 Go／G1期。 结论：根据黏附特性分离的猪骨髓MSCs在体外条件下可生长扩增，可用于5-aza 诱导转化为心肌样细胞。 慢病毒转染HCN4基因构建生物起搏细胞的体外研究 中文提要 ． 第二节5-aza体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的研究 目的：建立猪骨髓间充质干细胞体外转化为心肌样细胞的方法，为构建生物起搏 细胞提供新材料。 化学染色鉴定。 dcsmin、MHC、cTnI和Cx-43。 结论：根据黏附特性分离的猪骨髓MSCs在体外条件下可分化为心肌样细胞，可 用于构建生物起搏细胞。 包装 第一节穿梭质粒pCDHl．GFP．HCN4的构建 目的：将全长约3．6kb的hHCN4目的基因片段从DrStieber教授惠赠的 穿梭质粒pCDHl．MCSl．EFl．copGFP上。 ． 方法：用EcoRI和Xba Pucl9载体中，再用Eco 中。用XbaI或者EcoRI鉴定，将阳性克隆质粒送上海生工测序，并将构建的目的基 因质粒转染293细胞和猪骨髓间充质干细胞。 · 结果：XbaI及EcoRI鉴定表明，PCR的产物和克隆扩增的产物的电泳结果该基 全相同；构建的目的基因质粒转染293细胞和原代的猪骨髓间充质干细胞后，均发现 有强烈的绿色荧光的出现。 Ⅱ 慢病毒转染HCN4基因构建生物起搏细胞的体外研究 中文提要 第二节HCN4重组慢病毒的包装 Kit)建立稳定的 目的：使用慢病毒包装系统(pPACKHl．LentivectorPackaging HCN4重组慢病毒。 方法：实验过程参照SBI的Lentive沁tor ExpressionSystem的操作手册进行。将构 建好的慢病毒包装质粒混合物混合后感染293T细胞及心肌样骨髓基质干细胞。 结果：构建的慢病毒包装质粒混合物转染293细胞和