RNA干扰热休克蛋白27基因对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响.pdf

RNA干扰热休克蛋白27基因对自发性高血压大鼠血管平滑 肌细胞增殖、迁移的影响 中文摘要 smoothmuscle 血管平滑肌细胞(vascular cells，VSMCs)是血管壁的主要组 成成分，维系着血管壁的结构和功能。VSMCs从中膜迁移到内膜下对内膜增厚 程度及斑块的形成和稳定起至关重要的作用。内膜增厚是血管对各种损伤，如动 脉粥样硬化形成、支架植入及球囊扩张等的反应。可以说没有VSMCs的迁移， shock 就没有斑块的形成。热休克蛋白27(heat 克蛋白(thesmallheatshock protein，sHSP)家族中的重要一员，其重要的生物 学功能是保护细胞免受环境中自由基、热、缺血和毒性物质等各种应激因素导致 的损伤，参与细胞的增殖分化、细胞凋亡的信号转导调节及微丝的稳定，是细胞 interference， 迁移的关键调节因子。作为一种新的基因治疗方法，RNA干扰(RNA RNAi)以其特异性、高效性成为研究的热点。慢病毒载体具有可感染分裂细胞及 非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫 反应等优点，己成为当前基因治疗中理想载体。为此，我们利用RNAi干扰技术， 设计并合成针对自发性高血压大鼠HSP27基因的小干扰RNA片段，通过慢病毒转 功能及基因治疗奠定基础。 本课题分为三部分。 第一部分：自发性高血压大鼠HSP27基因RNAi慢病毒载体的构 建与鉴定 从Genbank获得HSP27基因序列。根据HSP27mRNA序列，设计、合成三 对带有Bgl 小发夹RNA(small PSUPElobasic．HSP27．1、PSUPER—basic．HSP27．2、 构建的PSUPER-basic．HSP27行EcoR I和HindIII双酶切鉴定。初步鉴定正确的 中的HSP27 shRNA表达结构进行酶切，插入到慢病毒转移质粒pNL． 超速离心收集病毒颗粒，转导293T细胞，测定慢病毒的滴度。结果显示：shRNA 生HSP27 出高滴度的病毒。 第二部分：靶向自发性高血压大鼠热休克蛋白27基因的慢病毒 对血管平滑肌细胞HSP27基因沉默作用 采用组织贴块法分离、培养SHR胸主动脉血管平滑肌细胞，三天后，细胞 SmoothMuscle 伸出组织块。两周后，细胞呈典型的‘谷和峰’生长模式。Alpha Actin单克隆抗体免疫细胞化学染色可见胞浆内呈棕黄色丝状条纹，VSMCs阳 实时荧光定量PCR(real．time HSP27 quantitativePCR，RTQ．PCR)检测VSMCs HSP27 蛋白表达水平。结果显示：RTQ．PCR显示，三对互补片段均有不同程度的干扰 效果，分别是：pNL．HSP27．IRES2．EGFP．1：O．7741 0．71 blot检测显示，HSP27蛋白质 1；pNL—HSP27．IRES2．EGFP．3：0．43。Western 相一致。 第三部分：干扰自发性高血压大鼠热休克蛋白27基因对VSMCs 细胞增殖、迁移的影响 通过细胞计数法和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测VSMCs细胞增殖， 记F—actin，用激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架的形态变化，采用改良的Boyden 4 VSMCs细胞迁移，抑制率分别为45．6％和40．0％(Po．01)。 结论