细胞生物学章(沈婷).ppt

细胞生物学研究方法 第一节：常用模式生物 第二节：细胞形态结构的观察方法 第三节：组分分析 第四节：细胞培养、细胞功能 （一）普通光学显微镜 ①照明系统 1. 构成： ②光学放大系统 ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。 普通复式光学显微镜技术 显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关。 分辨率是指区分开两个质点间的最小距离 几种介质的折射率 3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 ? R=0.61λ/N ．A ． – 其中λ为入射光线波长；N ．A ．为镜口率＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 ? 思考：如何提高显微镜的分辨能力？ （二）相差显微镜 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 用途：观察未经染色的玻片标本 特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。 特异蛋白质等生物大分子定性 定位研究，标本需特异荧光染料，光源为短波光 落射荧光显微镜的构造 用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。 （四）激光扫描共焦显微镜技术Laser Scanning Confocal Mircroscope laser confocal scanning microscope, LCSM 荧光共振能量转移（FRET）技术（P55） 是检测活体中生物大分子纳米距离和纳米距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。 FRET现象：当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，称FRET现象。 采用融合表达方式，可将两个蛋白的距离拉近于5～10nm。 FRET效率反映了被检的两种蛋白是否直接作用及作用的强弱。 荧光漂白恢复技术（P56） 又称光脱色恢复技术，可用于检测活体细胞表达或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。 原理：利用高能量激光束的照射使特定的区域的荧光发生不可逆的淬灭，光漂白区荧光的恢复可通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或胞质中运动至光漂白区来完成。 二、电子显微镜 电子显微镜与光学显微镜基本区别 不同光线的波长 TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM 2、制样技术 1）超薄切片 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。 2）负染技术 用重金属盐（如磷钨酸）对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 3）冰冻蚀刻 freeze-etching 亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。 （二）扫描电子显微镜 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。 Scanning electron microscope（ SEM） 扫描电子显微镜原理 一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。 转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。 转速25kr/min，离心力89kg者称为超速离心机。 目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500kg。 ? 特点： – 介质密度均一 – 速度由低向高，逐级离心 ? 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 ? 沉降顺序：核—线粒体—溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高基体—核蛋白体。 ? 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。 （二）显示方法 1. 金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 2. Feulgen反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示脱氧核糖核酸。 3. 联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生