佛手中活性成分提取分离及体外活性测试的研究.pdfVIP

Extraction and Separation of Effective Components from Bergamot and Their Biological Activities Study in vitro A Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Master ’s Degree of Science By Li Wenjuan Supervised by Prof. Xu Yi Specialty: Medicinal Chemistry College of Chemistry and Chemical Engineering of Chongqing University, Chongqing, China May, 2013 中文摘要 摘 要 佛手是芸香科植物香橼的干燥果实，主要含有挥发油、香豆素类、黄酮类、 多糖等化学成分，具有抗肿瘤、调节免疫、抗炎、抗氧化等药理作用，作为重庆 的一种道地药材具有较高研究价值。当前，对佛手植物的开发利用大多停留在其 挥发油成分方面，而对佛手中大量的其他活性成分及其相应的生物活性研究却较 少。据此，本文在综述佛手药材相关研究进展的基础上，对佛手的活性化学成分 及生物活性进行研究，为深入开发利用佛手资源提供科学依据。 本文的主要研究工作及成果包括： 1. 采用溶剂提取法对佛手进行了系统分离和鉴定。以 60% 乙醇溶液为溶剂对 佛手进行提取后，采用有机溶剂萃取，重点对石油醚、乙酸乙酯萃取层进行系统 分离，然后利用柱层析、重结晶、制备薄层色谱等方法进行分离纯化，依照理化 性质和与标准核磁图谱的对照，鉴定出了五种单体化合物，即：柠檬油素、滨蒿 内酯、伞形花内酯、佛手柑内酯和胡萝卜苷，为后续的抗肿瘤活性成分的筛选及 测试提供供试品。 2. 采用单因素实验与正交优化法对佛手多糖的水提工艺进行优化，确定提取 佛手多糖的最佳参数为：提取温度 90℃、料液比 1:15、提取时间 2h、提取次数 3 次。通过苯酚-硫酸法对佛手粗多糖中的总多糖的含量进行测定，测得佛手中总多 糖在粗多糖中含量为 61.51% 。采用逐级醇沉法对佛手多糖类成分进行初步分离， 逐级醇沉得三种粗多糖（FSP-1、FSP-2 和 FSP-3 ），得率分别为 5.75%、3.57%、4.34% ， 作为此后的抗氧化活性测试物。此外，采用 DEAE 纤维素柱层析法对佛手粗多糖 FSP-1 进行了分离纯化，得到 2 种纯多糖 （BP-1、BP-2 ），BP- 1 和 BP-2 水解后， 经 TLC 分析，发现其单糖成分均为葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖。 3. 采用体外细胞毒性测试实验，对分离得到的四种香豆素类成分（柠檬油素、 滨蒿内酯、伞形花内酯、佛手柑内酯）和佛手粗多糖的体外抗肿瘤作用效果进行 了测试。通过 96 孔板培养-荧光检测分析，测试了上述四种香豆素类成分和佛手多 糖的体外抗肿瘤作用，结合倒置显微镜观测了上述分离产物对细胞形态的影响。 研究显示，柠檬油素、滨蒿内酯和佛手柑内酯对 143B 人骨肉瘤细胞的生长有明显 的抑制作用，显微镜观测柠檬油素、滨蒿内酯和佛手柑内酯三种活性成分对肿瘤 细胞生长情况的影响，也显示出其对肿瘤细胞增殖具有抑制作用。 4.基于化学发光分析法建立了适用于佛手多糖体外自由基清除能力测试的抗氧化 活性评价方法。该方法根据系统化学发光被抑制的程度，评价佛手多糖对活性氧 自由基的体外的清除能力。实验通过优化化学发光体系实验参数，测试得到三种 I 重庆大学硕士学位论文 粗多糖（FSP- 1、FSP-2 和 FSP-3 ）的体外抗氧化活性数据。结果表明上述三种粗 多糖对羟基