来源于芽孢杆菌（Bacillus+circulans）β-半乳糖苷酶在毕赤酵母中高效表达.pdf

摘 要 我国人群中有很大一部分(约75％～95％)患有乳糖不耐受症，严重影响牛乳及乳制品的 推广‘。利川乳糖酶生产低乳糖乳及乳制品是解决乳糖不耐受症问题的最佳途径，因此，乳 糖酶在食品私J乳制品工业中的作用日益显著。而生产乳糖酶就必须解决目前乳糖酶单位产 量低、胞内酶生产复杂、适应范围窄等问题，以满足J二业生产多方面的要求。 本论文对来源于环状芽孢杆菌Bacilluscirculans的乳糖酶基冈lacO进行了优化改造， 在不改变其原有基因所编码的氨基酸序列的基础上，根据毕办酵母的密码子选择偏向，同 时综合在真核系统中影响基因转录、翻译及mRNA稳定性等因素，设计并全序列合成r适 合丁在毕赤酵母中高效表达的基因lacMo改造后的乳糖酶基冈与原基因相比，共改变了242 个碱基，涉及182个氨基酸。将合成的基因克隆到酵母表达载体pPIC9上，与酵母旺．因子 GSll5， 构建出了乳糖酶一I程菌株。从166株带有改造乳糖酶基因lacM的重组酵母中筛选到26株 表达乳糖酶的重组子，在摇床水平上甲醇诱导144h后最高的一株的乳糖酶表达量达到 2237．9U／mL发酵液。 实验证明。重组毕赤酵母中乳糖酶基因lacM得到了高教表达，表达量是朱改造基吲 lacO的3～5倍，表达产物能有效分泌且具有正常的生物学活性。说明对基冈的分子改造是 成功的。 内相对酶活力均在80％以上，具有较好的耐酸碱性。所试离子对酶促反应影响不人，其中 Zn”、K+和Fe”对酶略有激活作用，而Cu”、SDS对酶促反应有明显地抑制作用。 关键词： 乳糖酶， 基因改造，毕赤酵母， 高效表达 Abstract Lactasecallbeusedfortreatmentof“lactoseintolerance’andoflow—lactosemilk。 production andother oflactase are dairy low whey products．Mainproblems productionyield，complicateprocess from andnarrow ofderiving range． yeasts applied ThelacO aGalactosidasefromBacilluscirculansandwasmodifiedtothe geneencoding tacMgene without to biasincodon of andthe itsaminoacid the choice changing sequence．According yeast factorswhichaffectthe andthe ofmRNAin lacM gene stability eukaDote．the transcription，translation whichbefitfor inPichia Was and lacMWas gene expressionpastorisdesignedsynthesized．Thegene