TLR4基因编码区非同义SNPs对LPS刺激反应及其MFHAS1调控TLR4信号通路研究.pdfVIP

复旦大学附属中山医院2011年博士论文 中文摘要 脓毒症是指机体感染微生物后发生的全身炎性反应综合征，是ICU危重病 like 人死亡重要原因之一。ToU样受体4(Toll 4，TLR4)相关信号通路 receptor 在炎症反应中起了举足轻重的作用，因此其功能上的缺陷可能严重影响机体抵抗 炎症的免疫反应。TLR4通过病原体相关分子模式(PAMPs)识别病原体微生物， 激活并启动细胞内信号转导通路，诱导天然免疫的产生，是脓毒症发生发展的重 要病理生理机制。基于目前研究进展，本课题重点开展了两方面的系统研究：1． 利用生物信息学和基因克隆技术，探讨了TLR4基因编码区发生自然突变的非同 义SNPs对LPS刺激的反应，旨在为揭示TLR4基因多态性与脓毒症易感性的相 关研究提供分子生物学基础。2．利用分子生物学技术，探讨一个新的蛋白恶性纤 旨在为脓毒症的标靶治疗提供新的思路。 主要研究结果如下： 1．利用生物信息学，筛选出人TLR4基因编码区发生自然突变的非同义单 7个自然突变质粒。使用LPS刺激 变技术成功构建pEGFP。huTLR4质粒及相关1 后使用双荧光素酶法检测下游NF—rd3报告基因活性，结果显示其中A896G， 位点NF—r,B活性无明显差异。其后使用实时荧光定量PCR方法检测此三个SNP 位点下游炎性因子TNF．Q、IL．6 mRNA表达量均明显降低，进一步验证了该三 个SNP位点功能正常与否可影响TLR4信号通路的传递。 2．通过实时荧光定量PCR方法，检测发现TLR4基因敲除小鼠的单核巨噬 细胞中MFHASl的表达明显低于野生型小鼠。其后进一步通过RNA干扰技术沉 默野生型小鼠单核巨噬细胞中的MFHASlmRNA表达，使用LPS刺激小鼠单核 在TLR4信号通路中可能起负调控作用。 本课题通过不同方法和角度研究单核巨噬细胞中TLR4介导的天然免疫反 应相关信号通路时不同环节变化的机制，结果表明：(1)TLR4基因的三个突变 位点A896G、C1196T、A2081G是脓毒症发生易感性的重要分子生物学基础；(2) 在TLR4信号通路中MFHASl可能起负调控作甩。 (LPS)；恶性纤维性组织细胞瘤扩增顺序1(MFHASl) 复旦大学附属中山医院2011年博士论文 Abstract a andischaracterized isa thatisinitiatedinfection by Sepsissyndrome by like isa causeofdeathinICU．Toll inflammatory major receptor systemic response．It a rolein its 4(TLR4)signalingpathwayplayspivotal imflamMatoryresponse，thus defectiveness thehost maystronglyimpair anti—inflammatoryimmunity．TLR4 initiated incellul