肝损伤萃取物对不同物种BMSCs分化方向的影响及其微囊包被技术初探.pdf

肝损伤萃取物对不同物种BMsCs分化方向的影响及微囊包被技术初探 肝损伤萃取物对不同物种BMSCs分化方向的影响及 微囊包被技术初探 专 业：病理学与病理生理学 硕士生：刘大伟 指导教师：赵国强教授 摘 要 干细胞定向诱导分化是当前干细胞研究领域的一个热点问题。骨髓间质细胞 (BMSCs)是一类具有多向分化潜能的均质性成体干细胞，在特定诱导条件下可 向不同胚层的细胞分化，如：骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞、肝细胞 等。近年来，向肝系细胞分化的研究越来越受到人们的关注。本实验的前期研究 已成功实现了由骨髓间质细胞向肝细胞的诱导分化，证实了肝损伤组织萃取物对 骨髓干细胞的定向诱导活性，并初步揭示了肝损伤组织萃取物的分子基础。研究 显示，肝损伤组织萃取物内可能包含有骨髓间质细胞向肝细胞定向分化所需的信 息分子。然而，上述研究都是以大鼠模型为基础的，研究发现的大鼠肝损伤组织 萃取物的生物学活性是否对其他物种也起作用?换言之，大鼠肝损伤组织萃取物 的干细胞定向诱导活性是否具有物种广谱性?对于评估肝损伤组织萃取物的潜 在应用价值以及是否有进一步研究开发的必要性，无疑具有十分重要的意义。 如上所述，我们已实现了由骨髓间质细胞向肝细胞的诱导分化，并经动物实 验证明这些骨髓源肝细胞能够代偿衰竭的肝脏功能，可作为细胞移植和生物反应 器研制的细胞源。然而，如何解决免疫隔离问题则是我们必须跨越的技术屏障。 文献分析显示，ACA微囊比较适合细胞移植和生物反应器对免疫隔离的要求。因 此，能否利用海藻酸钠和壳聚糖等材料成功地制作出ACA微囊、微珠等细胞载 体?能否实现微囊／微珠与细胞的成功结合?如何提高微囊／微珠内细胞的存活 率并保持其生物活性?若能解决这一系列技术问题，对于细胞移植技术的发展及 肝损伤萃取物对不同物种BMSCs分化方向的影响及微囊包被技术初探 生物反应器的研制无疑具有十分重要的意义。 基于目前的研究现状以及本研究组前期的工作结果，本实验拟采用大鼠肝损 伤组织萃取物分别对源自大鼠、人和新西兰兔的BMSCs进行诱导分化，以观察不 同物种来源的细胞对大鼠肝损伤组织萃取物的应答能力，从而判断大鼠肝损伤组 织萃取物对骨髓间质细胞的诱导活性是否具有物种广谱性。同时，为了解决细胞 移植所引起的免疫隔离问题我们初步探索了ACA微囊／微珠技术，为细胞移植技 术的发展及生物反应器的研制做必要的准备。 实验方法 一、肝损伤萃取物对不同物种BMSCs分化方向的影响： 1．肝损伤大鼠模型的构建及肝组织萃取物的制备 选取SD大鼠为实验动 物，以2．AAF，CCl4程序构建肝损伤动物模型。取动物肝脏，制备肝组织萃取物。 2．肝组织萃取物生物活性的鉴定 以肝组织萃取物作为刺激物对大鼠骨髓 以及分子表达谱特征(分化状态)确认肝组织萃取物的生物活性。 3．三个物种BMSCs的获取和培养。 4．利用同批次相同诱导强度的肝损伤萃取物诱导液同时对三个不同物种的 BMSCs进行诱导培养。 5．分别在第5、7、10和20天收集诱导中的细胞，并拍照记录下不同时间 的形态特征。 、 6．利用RT—PCR技术分析不同物种在不同诱导时间的分子表达谱。 二、微囊包被技术初步探索： 1．利用自制微囊制备仪制备微载体，在倒置相差显微镜下观察微载体的形 态。 2．扫描电镜观察微球和微珠表面超微结构。 3．尝试模拟滚动培养和静置培养载细胞微珠，并观察不同培养方式下微珠 内细胞生长活性和细胞形态。 II 肝损伤萃取物对不同物种BMscs分化方向的影响及微囊包被技术初探 实验结果 1．三个物种BMSCs在诱导过程中形态学变化十分相似。在诱导的第5天见 一部分短梭形细胞变为类圆形细胞(图3—4)，且细胞生长速度明显减慢；诱导第 10天，类圆形细胞逐渐变为多角形类上皮样形态，细胞灶状分布逐渐凸显，导第 20天，灶状分布的类上皮样细胞十分明显，呈簇状缓慢生长，中央区域细胞多角 形明显(人BMSCs变化更为明显)。 2．大鼠、人和新西兰兔BMSCs在肝