李斯特菌分子鉴定和分型及在安全牛奶生产中的应用.pdf

摘 要 monocytogenes，三卅)是人畜共患病李斯 龟核细胞增多性李斯特菌(Listeria 特菌病的病原菌，为一革兰氏阳性小杆菌，可以在多种细胞内生存和繁殖a此 菌有如下特性：1)在自然界中普遍存在：2)易感动物多，除人外还可感染多 种哺乳动物，以牛、羊、犬最易感染；3)可在低温下生长(4-8。C)，对热有一 定抵抗力。此病原菌主要经消化道感染，也可经眼结膜及破损皮肤接触感染。 临床上有脑膜炎、败血症等表现形式，死亡率30％左右。孕妇或孕畜还可发生 流产、早产、死胎等。近二十年来，世界各地食源性人的李斯特菌病日渐增多， 流行病学调查结果表明，该病主要是由于人食用了污染Lm的食品而引起。但 是由于该蔚在多种动物和环境中广泛存在，在食品生产和加工过程中可通过多 种途径进入成品食品中，对消费者健康构成潜在威胁。因此，建立加的快速鉴 定和分子分型方法对于开展食品(特别是消毒牛奶)加工过程中Lm污染来源 和途径的调查和控制，提高食品的微生物卫生质量具有重要意义。7 本项目首先对FDA法、NGFIS法和国标法三种李斯特菌选择性增菌肉汤进 行对比试验，结果表明：改良的NGFIS法对环境样品李斯特菌的分离率最高， FDA法对消毒牛奶中李斯特菌的检出率最高。本试验以具有李斯特菌种、属特 异性的iap基因和单核细胞增多性李斯特菌特异的溶血素基因(hlyA)作为靶目 标，分别设计单一PCR、双重PCR和三重PCR来鉴定李斯特菌，并比较了三 种PCR方法的特异性。结果表明：建立的单一PCR只能鉴定Lm，而双重PCR 和三重PCR方法对于李斯特菌属和Lm标准株均具有良好的特异性，但是双重 PCR不能鉴定部分Lm食品分离株，而三重PCR不仅可用于李斯特菌属细菌的 特异性鉴定还可用于混合培养物中Lm的特异性鉴别。本研究还建立了用于追 踪牛奶加工过程中Lm污染源和污染途径的RAPD分型方法，为了提高RAPD 分型法的重复性和分辨力，本研究采用两条随机引物分别进行RAPD，综合分 析结果的策略。结果表明：建立的RAPD方法对17株不同来源的￡m分离株均 具有良好的分型性和分辨力，并对Linnocua亦有良好的分辨力和可分型性。 总之，本试验所建立的三重PCR和RAPD分型方法为进一步开展牛奶生产 加工过程中李斯特菌污染的监控奠定了基础。 关键词。李斯特菌属细菌 单核茹菌j旨爱蛙李斯特菌 PcR鉴定RAPD分型 一}．防： ＼、＼ 。 ，、狲，小l玉 6 Abstract a listeriosis’is zoonoticdisease ofthe Listeria causative agent monocytogenes，the ofmammaliancells thatcall inanumber small rod proliferate including gram．positive asoneofthemost food·borne has considered been impor