引物设计及测序结果分析PPT(精).pptVIP

* 对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数?  * * 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。 引物过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5℃），退火温度根据较低的Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。Tm值可 以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大 多数都采用这种方式。（注：对于Tm值的计算有争议的地方是附加序列应不应该计算在内，我觉得有值得商讨的地方。因为从理论上只有最开始的循环引物的附加 序列是不与模板链结合的，而在后来的PCR反应中，引物的