第四章核酸操作技术.ppt

从原理上，超离心分三种类型： ⅰ差速离心 对一个混合物组份通过改变离心速度（差速）使各组份分开的技术。 特点是技术简单、速度快、样品悬浮不受用量的影响，但缺点是很难得到完全纯化样品。 ⅱ沉降平衡法又称密度梯度离心法 （CsCl密度梯度离心） 在离心时混合物各组份不沉至管底而是停留在事先制好的或在离心中型成的不同密度的介质中，使之处于平衡状态（此时样品的流动速度为零）从而使物质分开，比如把样品加在相当稠密的小分子溶液(CsCl)中，在离心时形成梯度并使大分子进入与它的力的总和为零的区域（即离心力和浮力相等）这个区域的密度等于大分子的密度也称该分子的浮力密度(ρ)此法称浮力密度梯度离心(BGC)。 在具体工作中介质的选择、浮力密度确定等改进有很多（例如加EB，线性结合强，可区分线性和环形。 根据文献在相似的条件比较核酸浮力密度： ssRNA(单链RNA) ＞dsRNA(双链) ＞ssDNA＞dsDNA＞tRNA.蛋白 ⅲ沉降速度又称速度区带离心法 在超离心时样品以不同的速度沉至管底，若两种或多种界面，从界面的移动（产生）可以测不同溶质的分子量并把混合物分开称沉降速度法。 上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤 可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片，保留上清液。 使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心 使RNA分离：RNase处理或超速离心 使DNA与其它可溶物分离 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图 Trizol（invitrogen） CTAB 去污剂，溶解细胞膜，高盐溶液中与核酸共溶。 β-巯基乙醇 抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA。 SDS 裂解细胞，释放核酸。 苯酚 使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。 （1）水饱和酚又叫水平衡酚；PH小于7，通常与异硫氢酸胍一起使用，用于RNA的提取； （2）Tris饱和酚一般PH大于7.8，用于DNA的提取。 一、核酸的检测 1.紫外光谱分析法 远紫外（10-200nm）：实验中难以实现； 近紫外（200-400nm)：通常意义上。 纯DNA：A260/A280＞1.8 纯RNA:A280/A260≈2.0 A=1，含50μg/ml的双螺旋DNA或40μg/ml单链DNA或RNA，或20μg/ml寡核苷酸。 使用EB染色的注意事项 核酸凝胶电泳的原理： 各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场作用下向相反的电极移动；在生理条件下，核酸分子（DNA和RNA）的多核苷酸链呈现多聚阴离子的特性。当核酸分子被放在电场中时，它们就会向正极方向移动。 （二）DNA迁移速率的影响因素 1.凝胶浓度 染色剂：溴化乙锭（ethidium?bromide,?EB） 电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂： （1）溴化乙锭（ethidium?bromide,?EB） 最常用的核酸荧光染料，可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深，可将凝胶浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L?MgCl2中5min，使非结合的EB褪色，这样可检查到10ng的DNA样品，EB也可用于检测单链DNA或RNA，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。 终浓度：0.5μg/ml的EB， （EB见光易分解，应于4℃避光保存） （2）吖啶橙（acridine?orange,?AO）： 吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格，应在22℃，0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时。 （3）银（Ag+）试剂： Ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。AgNO3等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链，双链DNA及RNA都染成黑褐色。银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高100～1000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中，能检测出0.5ng的RNA，其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色，而且对