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重组家蚕丝素重链蛋白的构建与表达 中文摘要 重组家蚕丝素重链蛋白的构建与表达 中文摘要 蚕丝作为一种天然的动物蛋白质，越来越多地被研究用作生物材料，尤其是组织 工程支架。丝素蛋白生物材料的应用主要是作为组织修复用材料，而修复不同的组织， 对于材料的结构和性能也有不同的要求，材料的结构性能由蛋白质的二级结构所决定， 二级结构取决于蛋白质氨基酸的组成及其排列顺序。组成家蚕丝素蛋白主要有重链， 轻链和P25 蛋白，每段序列的存在对丝素蛋白的结构性能都有特定的意义，也是我们 必须要弄清楚的科学问题。作为丝素主要组成部分的重链，由结晶和非结晶区交错排 列组成，结构有序、规整，有利于合理设计。本文对丝素重链进行分析设计，为了更 好地研究蛋白质序列-结构-功能间的关系，我们采用基因工程技术将家蚕丝素重链结 晶区非结晶区的基因序列重组克隆，采用微生物大肠杆菌表达系统大量表达制备蛋白、 分离纯化，并初步对表达产物进行了定性定量分析，为研究家蚕丝素重链各个序列对 丝素结构与功能(尤其生物学功能) 的影响提供材料及制备方法。 分析家蚕丝素蛋白重链的基因序列及编码的氨基酸序列，结合本课题之前的设计 研究，本文将设计的几种典型的结晶区重复肽段(GAGAGX)16(X=A,S,V,Y)与非结晶区 肽段(F)进行基因重组，将结晶区重复肽段(GAGAGS)16 与不同倍数非结晶区(Fn)进行 基因重组，并构建了重组基因的pGEX 系列表达载体。采用PCR 方法克隆了家蚕丝 素重链的 C-末端多肽序列的编码基因，构建了克隆质粒，为以后进一步与丝素重链 核心区重组奠定基础。通过琼脂糖凝胶电泳和DNA 测序鉴定了所有克隆质粒和表达 载体构建的正确性，没有发生任何基因突变和缺失。 将构建的表达载体转染大肠杆菌BL21 中加入IPTG 诱导表达。经过SDS 电泳和Western blot 技术分析表明表达载体pGEX 能很好地表达目的蛋白。本文重点 研究了丝素重链结晶区(GAGAGS)16 肽段与不同倍数非结晶区肽段的重组基因的优化 表达条件，主要包括表达载体 pGEX-gs16f 1 、pGEX-gs16f4 、pGEX-gs16f8 和 pGEX-gs16f 12，其相对应的表达产物为谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签的融合蛋白 GST-GS16F1、GST-GS16F4、GST-GS16F8 和GST-GS16F12 。调查了诱导剂异丙基-β-D I 中文摘要 重组家蚕丝素重链蛋白的构建与表达 硫代半乳苷糖(IPTG)不同浓度(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mmol/L) 和不同诱导培养时间(0，1，2 ，3，4 ，5，6，7，8 h )对GST-GS16F1 、GST-GS16F4、 GST-GS16F8 和 GST-GS16F12 表达的影响，结果表明四种融合蛋白最佳表达的诱导 剂浓度分别为0.2 mmol/L、0.1 mmol/L、0.4 mmol/L 和0.6 mmol/L ；诱导培养时间分 别为3 小时、4 小时、6 小时和3 小时。 大量表达了三种融合蛋白GST-GS16F 1，GST-GS16F4 和GST-GS16F8，采用GST 亲和层析柱分离纯化，SDS结果显示均获得了纯度较高的单一蛋白。利用紫外 分光光度计测得三种融合蛋白在最佳IPTG 浓度和培养时间下的表达产率分别为每升 菌液菌细胞表达53.20 、30.59 和14.02 mg 左右。 纯化并超滤后的融合蛋白GST-GS16F 1，GST-GS16F4 和GST-GS16F8 采用凝血 酶酶切后分离得到目的肽段GS16F 1，GS16F4 和GS16F8。对融合蛋白和目的肽段进 行了质谱分析，测量结果得到的分子量与理论值相一致。 对纯化并超滤的三种融合蛋白GST-GS16F 1，GST-GS16F4 和GST-GS16F8 进行 了等电点性质的测定和氨基酸组成分析。Zeta- 电位分析显示融合蛋白 GST-GS16F4 和GST-GS16F8 的等电点在4~4.5 之间，GST-G