Flavobacteriaceae+sp.CZ1127产岩藻聚糖硫酸酯酶的分离纯化、性质研究和应用.pdf

Flavobacteriaceae sp. CZ1127 产岩藻聚糖硫酸酯酶的分离纯化、性质研究及应用 Flavobacteriaceae sp. CZ1127 产岩藻聚糖硫酸酯酶的分离纯 化、性质研究及应用 摘 要 岩藻聚糖硫酸酯是海参体壁的重要组成成分之一，具有多种生理活性。多糖 降解后一方面有利于其结构解析，另一方面有可能提高其原有活性，而酶解法是 目前实现多糖降解最为理想的途径。实验室前期自主筛选出一株海洋细菌 Flavobacteriaceae sp. CZ1127，其胞内能产生岩藻聚糖硫酸酯酶，可以降解多种 海参的岩藻聚糖硫酸酯。本研究在此基础上，进一步对CZ1127产岩藻聚糖硫酸 酯酶进行了分离纯化，并对其酶学性质及应用进行了研究。 首先建立了基于pHBH法的岩藻聚糖硫酸酯酶酶活定量方法：准确移取375 μL 0.055%岩藻聚糖硫酸酯溶液( 以pH 7.0 20mmol/L Tris-HCl 缓冲液溶解，内含 0.3mol/L NaCl) ，加入375μL 酶液，混匀后于28 ℃酶解反应30min，随后加入pHBH 试剂250 μL，100℃反应5 min，迅速冷却后于415 nm处测定吸光值，根据单位时 间内还原糖的产生量计算酶活。该方法酶活检测限达0.048mU ，约为DNS法1/20， 且方法灵敏度高、精密度高，可以满足微量测定的需求。 通过Cellufine Sulfate 亲和色谱、Mono Q 5/50 GL 阴离子交换色谱及Superdex 75 10/300 GL 凝胶过滤色谱等色谱技术的联用实现了对 Flavobacteriaceae sp.CZ1127 胞内酶液中岩藻聚糖硫酸酯酶的纯化，并对其纯度进行了鉴定。纯化 得到电泳纯岩藻聚糖硫酸酯酶，酶活回收率为1.8%，纯化倍数为1476.5， SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其分子量为46kDa 。对CZ1127 产岩藻聚糖硫酸酯酶的 酶学性质研究表明：该酶最适反应温度为35℃，酶液在4 ℃下稳定性较好；最适 反应pH 为6.5，在pH 6.5-9.0 的范围内酶活较为稳定；酶活的启动需要NaCl 的 存在，且NaCl 浓度为0.15 mol/L 时酶活最高；Cd2+ 、 Hg2+ 、Zn2+对酶活有很 强的抑制作用，而Ca2+对酶活有明显的促进作用。 利用 Cellufine Sulfate 亲和色谱及 Mono Q 5/50 GL 阴离子交换色谱对 Flavobacteriaceae sp.CZ1127 胞内酶中硫酸酯酶进行了初步的纯化。对其酶学性 质研究表明：该酶最适反应温度25 ℃，酶液在4 ℃下稳定性相对较好，但失活速 度仍较快，24h 时酶活剩余量为69.6% ；最适反应pH 为8.5；在pH 7-8.5 的范围 内酶活较稳定，pH 为6 时酶活剩余不足10%；酶活的启动不需要NaCl 的存在， Flavobacteriaceae sp. CZ1127 产岩藻聚糖硫酸酯酶的分离纯化、性质研究及应用 但添加适量NaCl 有利于提高酶活，且当NaCl 浓度为0.3 mol/L 时酶活最高。通 过调节酶液pH 至6.0 并在4 ℃下贮存48 小时，硫酸酯酶活力仅残余9.7%，而岩 藻聚糖硫酸酯酶酶活剩余80.3%，能够简单有效的实现硫酸酯酶的特异性消除。 通过研究酶解反应过程中加酶量、酶解时间与酶解产物分子量的关系，构建 了预测海参(海地瓜) 中岩藻聚糖硫酸酯酶解产物分子量的反向传播-人工神经网 络模型，实现了对海地瓜岩藻聚糖硫酸酯酶解过程的预测与控制。构建的 BP-ANNS 为单隐层人工神经网络，网络输入值为加酶量和酶解时间，网络输出 值为酶解产物分子量，隐层神经元7 个，隐层传递函数为logsig，输出层传递函 数为purelin ，训练函数为trainglm 。其收敛步长为74，MSE 为0.00943，预测数 据和真实值的误差平均为1.06%，能够准确预测降解产物的分子量。 综上所述，本文建立了岩藻聚糖硫酸酯酶酶活定量方法，获得了CZ1127 产 岩藻聚糖硫酸酯酶的纯化产物并对其酶学性质进行了研究，建立了海参岩藻聚糖 硫酸酯的酶解模型，为CZ1127 产岩藻聚糖硫酸酯酶及海参岩藻聚糖硫酸酯降解 产物的利用奠定了基础。